Et kirurgisk fremgangsmåde er beskrevet for at eksponere den ventrale kraniet hos nyfødte rotter. Med denne fremgangsmåde er det muligt at åbne en kraniotomi at udføre akut elektrofysiologi og to-foton mikroskopi eksperimenter i hjernestammen af bedøvede hvalpe.
Anvendelsen af en kraniotomi til in vivo eksperimenter giver en mulighed for at undersøge dynamikken i forskellige cellulære processer i pattedyrs hjerne i voksenalderen og under udvikling. Selv om de fleste in vivo metoder bruger en craniotomy til at studere hjernen regioner, der ligger på den dorsale side, hjernestammen regioner såsom pons, der ligger på den ventrale side forbliver relativt understudied. Det vigtigste mål med denne protokol er at lette adgangen til ventrale hjernestammen strukturer, så de kan studeres in vivo ved hjælp af elektrofysiologiske og billeddannende metoder. Denne fremgangsmåde giver mulighed for undersøgelse af strukturelle ændringer i langtrækkende axoner, mønstre af elektrisk aktivitet i single og ensembler af celler, og ændringer i blod-hjerne barrieren permeabilitet i nyfødte dyr. Selv om denne protokol er blevet anvendt for det meste til at studere den auditive hjernestammen hos nyfødte rotter, kan det nemt tilpasses til studier i andre gnaver arter såsom nyfødte mus, voksen Rodents og andre hjernestammen regioner.
Anvendelsen af en kraniotomi i kombination med fluorescensimagografi og elektrofysiologiske teknikker tillader overvågning blodgennemstrømning, blod-hjerne-barriere-permeabilitet og måling af aktiviteten af neuroner og gliaceller i levende dyr 1-3. Adskillige laboratorier har brugt denne metode til at give indsigt i hjernens fysiologi i sunde og sygdomstilstande, men der er stadig huller i vores forståelse af, hvordan disse processer opstå under udvikling. Endvidere har de fleste undersøgelser fokuseret på de områder af hjernen, som er let tilgængelige fra ryg overfladen af kraniet, således at ventrale hjernestammen strukturer med forskellige fysiologiske roller er blevet studeret de fleste bruger ex vivo metoder.
Det vigtigste mål med denne protokol er at give en metode til at åbne en kraniotomi på den ventrale kraniet af gnavere. Denne fremgangsmåde blev tilpasset fra klassiske studier udført i større pattedyr, såsom hunde og katte til sensoriske neurofysiologi Recordings af det auditive hjernestamme 4-7. I denne protokol er der dog romanen udfordring at udføre proceduren i nyfødte dyr. Brug landmærker vaskulatur, har det tilpasset protokol tidligere været anvendt til at studere den auditive hjernestammen af nyfødte rotter, voksne mus og andre hjernestammen regioner som ringere oliven 8-11 (figur 1).
En væsentlig fordel ved en ventral kraniotomi i forhold til eksisterende metoder til at studere ventrale hjernestammen kerner er, at det giver direkte adgang til de strukturer af interesse i levende dyr. For eksempel er de auditive celler af den overlegne olivary kompleks lokaliseret nogle få snese mikrometer fra hjernens overflade, som er vigtig for målrettet placering af prober og til anvendelse af to-foton-billedteknik hvor billeddannelse dybde kan begrænses til 0,5 mm ved lys væv spredning og absorption. En ventrale kraniotomi giver også et præparat med relativt intakte neurale forbindelser, WHICH er forstyrret i akutte og organotypiske skive præparater 12. I modsætning til andre protokoller til in vivo neurofysiologi eksperimenter 13, kan en ventral tilgangen kombineres med multi-elektrode optagelse og billeddiagnostiske metoder, der giver oplysninger om cellulære ensembler (figur 6 og 7). Endelig, i kombination med denne protokol en fluorescens-mærket opløst stof kan injiceres i karrene at måle ændringer i blod-hjerne-barriere-permeabilitet til det opløste stof (figur 8).
Tid er kritisk. En erfaren forsker bør være i stand til at fuldføre denne protokol i 1 time (trin 1-3). Begrundelsen for de forskellige trin tider antager en medium til høj grad af ekspertise. Korrekt og rettidig trakeostomi og intubation er kritiske, da dårlig ventilation kontrol kan føre til kvælning og død for dyret. Omhyggelig clearance af muskel-og fedtvæv er også meget vigtigt, fordi fejl kan føre til ukontrolleret blødning og død for dyret. Tilsvarende, når udarbejdelsen af halspulsåren for kanyle indsættelse, er man nødt til at stramme og skære arterien omhyggeligt, hvis tråden knude bliver løs ukontrolleret blødning vil finde sted. Endelig bør kraniotomi gøres omhyggeligt, uden at forstyrre vartegn kar. Careless fjernelse af det ydre meningeal lag (dura), kan føre til alvorlige blødninger og skader på den arterielle forsyning.
Ventilation indstillinger vælges efter dyrets alder.De fleste kommercielle leverandører give nyttige oplysninger om disse indstillinger. Forsøg med rotter er ældre end P15 vil kræve anvendelse af et stort dyr ventilator. Voksne dyr måske ikke brug for ventilation, hvis bedøvet med ketamin / xylazin, men anbefales intubation for at undgå væske ind i luftrøret.
En af de største begrænsning af denne protokol er, at eksperimenter kan kun udføres akut. I vores laboratorium har vi foretaget eksperimenter varighed på mellem to og op til ti timer. En anden begrænsning er, at forsøgene skal udføres under bedøvelse. Derfor er valget af bedøvelsesmiddel er en vigtig variabel at overveje i planlægning og design af eksperimenter. Et beslægtet problem er, at nyfødte dyr kan være særligt følsomme over for overdosering. For eksempel, hvis du vælger ketamin / xylazin mix, beregne dosis baseret på pup vægt og administrere lægemidler på ⅓ af den maksimale lydstyrke. Kontroller tilstanden af dyret hver 5-10 minutter ved tå knivspids response. Hvis du bruger isofluran, er der også behov forholdsregler for at opretholde et sikkert miljø for investigator (ordentlig ventilation, og en korrekt kalibreret fordamper).
Stereomikroskop kan monteres på en fleksibel holder til at justere betragtningsvinkel og lette plads clearance at placere elektroderne og flytning af dyret for to-foton mikroskop. Anvendelse af et batteri til magten ventilatoren kan lette at flytte dyr og reducere elektriske artefakter under elektrofysiologiske eksperimenter. Til dette formål kan en lille breadboard (7,5 x 12 inches) anvendes til at samle sammen ventilatoren varmepuden og bedøvede dyr (figur 2a). En nyttig og vigtig modifikation denne opsætning er tilføjelsen af en indretning til overvågning af vitale tegn i løbet af operationen. En oxymeter eller andre analoge enheder kan bruges, afhængigt af laboratoriets budget.
Denne protokol er blevet anvendt med elektrofysiologi og billedbehandling opfyldttoder, herunder patch clamp optagelser 8,10,11, polytrode optagelser (fig. 7), og to-foton billeddannelse 9 (figur 6 og 8). En mulig fremtidig anvendelse vil være at kombinere disse metoder til målretning fluorescens-mærkede celler til elektrofysiologiske optagelse 16.
Nye programmer til billedbehandling kan også omfatte 2-D eller serie 3-D tid ved hjælp af to-foton mikroskopi. For eksempel ved hjælp af bolus lastning af calcium indikatorer til at studere aktiviteten af hjernestammen neuronal og glial cellepopulationer. Som vist i figur 8, et farvestof opløsning injiceres i blodcirkulationen gennem halspulsåren kan bruges til at generere billeder med høj kontrast af hjernen vaskulaturen. Som fluorescens farvestof fylder mikrokar lumen og spredes i det omgivende væv, kan det ikke kun anvendes til at beregne den tilsyneladende opløste permeabiliteten af blodhjernebarrieren, men også det opløste diffusion coefkelige i hjernevævet 3. En af hovedårsagerne til at injicere fluorescensmærkede opløste via halspulsåren at farveopløsningen direkte kan gå til mikrokar i hjernen uden at gå til hjertet først som en injektion i halevenen. Dette bringer mindst to fordele. Den ene er, at koncentrationen fluorescens farvestof i mikrokardannelse lumen kan være praktisk talt konstant hvis perfusionshastigheden fastsættes på kanyleringssted. Dette sikrer en nøjagtig bestemmelse af blod-hjerne-barriere-permeabilitet. En anden er, at hvis en prøve middel er inkluderet i perfusatet, vil det gå direkte til blod-hjerne-barrieren uden at blive fortyndet eller kombineret med andre faktorer fra kroppen cirkulation.
Nye eksperimenter kan også drage fordel af transgene dyr med genetisk kodet fluorescerende journalister. Dette ville give den fordel, at fluorescerende prober ikke behøver at blive indlæst i situ (medmindre udformningen af forsøgetanfører andet), hvilket sparer tid og eventuelt giver mulighed for mere intakte præparater (f.eks kraniel vindue 17).
Endelig kan forsøgene gøres i andre hjernestammen regioner, såsom ringere oliven eller ansigtets motoriske kerne. Viden om neuroanatomi og udvikling af specifikke cellulære populationer i en given art vil være vigtigt i denne retning, især da anatomiske kendetegn kan ændre sig som dyr vokse (Figur 1). Vi håber, at denne protokol opfordrer andre til at studere ventrale hjernestammen strukturer ved hjælp af in vivo elektrofysiologiske og billeddannende metoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud G12-RR003060 fra NIH / NCRR / RCMI indrømme SC1HD068129 fra Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation cbet 0.754.158 og PSC-CUNY 62.337-00 40 fra City University of New York.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |