En kirurgisk metode er beskrevet å eksponere ventral skallen i nyfødte rotter. Ved hjelp av denne tilnærmingen er det mulig å åpne en kraniotomi å utføre akutt elektrofysiologi og to-foton mikroskopi eksperimenter i hjernestammen av bedøvet valper.
Bruken av en kraniotomi for in vivo-eksperimenter gir en mulighet til å undersøke dynamikken i diverse cellulære prosesser i hjernen hos pattedyr i voksen alder og under utvikling. Selv om de fleste i vivo tilnærminger bruke en kraniotomi å studere hjerneregioner som ligger på ryggsiden, hjernestammen regioner som pons, som ligger på baksiden side forblir relativt lite studert. Hovedmålet med denne protokollen er å lette tilgangen til ventral hjernestrukturer, slik at de kan studeres in vivo ved hjelp av elektrofysiologisk og imaging metoder. Denne tilnærmingen gjør studie av strukturelle endringer i langtrekkende axons, mønstre av elektrisk aktivitet i singel og ensembler av celler, og endringer i blod-hjerne barrieren permeabilitet i nyfødte dyr. Selv om denne protokollen har blitt brukt mest til å studere den auditive hjernestammen i nyfødte rotter, kan det lett bli tilrettelagt for studier i andre gnagerarter som nyfødte mus, voksen rodents og andre hjernestammen regioner.
Bruken av en kraniotomi i kombinasjon med fluorescens avbilding og elektrofysiologiske teknikker tillater overvåking blodstrøm, blod-hjerne-barrieren permeabilitet og å måle aktiviteten av neuroner og gliaceller i levende dyr 1-3. Flere laboratorier har brukt denne tilnærmingen til å gi innsikt i hjernens fysiologi hos friske og sykdomstilstander, men hullene forbli i vår forståelse av hvordan disse prosessene oppstår under utvikling. Videre har de fleste studier fokusert på områder av hjernen som er lett tilgjengelig fra framsiden av skallen, slik at ventral hjernestrukturer med forskjellige fysiologiske roller har blitt studert det meste ved hjelp ex vivo tilnærminger.
Hovedmålet med denne protokollen er å gi en metode for å åpne en kraniotomi på ventral skallen av gnagere. Denne tilnærmingen ble tilpasset fra klassiske studier utført i større pattedyr som hunder og katter for sensoriske nevrofysiologi recordings av den auditive hjernestammen 4-7. I denne protokollen er det imidlertid den nye utfordringer for å utføre fremgangsmåten i nyfødte dyr. Ved hjelp av landemerker blodkar, har dette tilpasset protokoll blitt brukt tidligere for å studere den auditive hjernestammen av nyfødte rotter, voksne mus og andre hjernestammen regioner som mindreverdig oliven 8-11 (Figur 1).
En viktig fordel med en ventral craniotomy over eksisterende metoder for å studere ventral hjernestammen atomkjerner er at det gir direkte tilgang til strukturer av interesse i levende dyr. For eksempel er de auditive celler av den overlegne olivary kompleks lokalisert noen titalls mikrometer fra hjernen overflaten, noe som er viktig for målrettet plassering av prober og for bruk av to-foton avbildnings tilnærminger hvor avbildningsdybde kan begrenses til 0,5 mm ved lys vev spredning og absorpsjon. En ventral craniotomy gir også en forberedelse med relativt intakte nerveforbindelser, which blir forstyrret i akutte og organotypic slice forberedelser 12. I motsetning til andre protokoller for in vivo eksperimenter nevrofysiologi 13, kan en ventral metode kombineres med flerelektrode-opptak og avbildningsmetoder som gir informasjon om cellulære ensembler (figurene 6 og 7). Til slutt, i kombinasjon med denne protokoll et fluorescensmerkede oppløst stoff kan sprøytes inn i det vaskulære karet for å måle forandringer i blod-hjerne-barrieren permeabilitet til oppløst stoff (figur 8).
Tiden er kritisk. En erfaren forsker bør være i stand til å fullføre denne protokollen i en time (trinn 1-3). Oppgitte for de ulike trinnene ganger anta en middels til høy kompetanse. Riktig og rettidig trakeotomi og intubasjon er kritisk, ettersom dårlig ventilasjon kontroll kan føre til kvelning og død av dyret. Nøye clearance av muskel-og fettvevet er også meget viktig, fordi feil kan føre til ukontrollert blødning og død av dyret. Tilsvarende, når du forbereder halspulsåren for kanyle innsetting, må man stramme og kutte pulsåren nøye, hvis tråden knute blir løs ukontrollert blødning vil finne sted. Endelig bør craniotomy gjøres nøye, uten å forstyrre de landemerker blodkar. Uaktsom fjerning av det ytre hinne-lag (Dura) kan føre til alvorlig blødning og skade av arteriell tilførsel.
Ventilasjonsinnstillinger er valgt i henhold til alder på dyret.De fleste kommersielle leverandører gir nyttig informasjon om slike innstillinger. Forsøk på rotter eldre enn P15 vil kreve bruk av et stort dyr ventilator. Voksne dyr trenger kanskje ikke ventilasjon hvis bedøvet med ketamin / xylazin, men intubasjon anbefales å unngå væsken inn i luftrøret.
En hoved begrensning av denne protokollen er at eksperimenter kan kun utføres akutt. I vårt laboratorium har vi utført eksperimenter som varer mellom to og opp til ti timer. En annen begrensning er at eksperimenter må utføres under anestesi. Derfor er valg av anestesi en viktig variabel for å vurdere i planlegging og utforming av eksperimenter. Et beslektet problem er at nyfødte dyr kan være spesielt følsomme for overdosering. For eksempel, hvis du velger ketamin / xylazin mix, beregne dosen basert på pup vekt og administrere legemidler på ⅓ av maksimalt volum. Sjekk tilstanden til dyret hvert 5-10 minutter med tå klype response. Hvis du bruker isofluran, er forholdsregler også nødvendig for å opprettholde et trygt miljø for etterforskeren (god ventilasjon, og en riktig kalibrert fordamper).
Den stereomikroskop kan være montert på en fleksibel holderen for å justere synsvinkel og letter plass klaring for å plassere elektrodene og flytting av dyret til to-foton-mikroskop. Bruk av et batteri for å drive ventilatoren kan det lettere å flytte dyret og redusere elektriske gjenstander under elektrofysiologiske eksperimenter. For å oppnå dette, kan en liten brødfjel (7,5 x 12 inches) brukes til å montere sammen ventilator, varmeputen og bedøvet dyret (figur 2a). En nyttig og viktig modifikasjon til dette oppsettet er i tillegg en enhet for overvåking av vitale tegn under operasjonen. En oxymeter eller andre analoge enheter kan brukes avhengig av laboratoriet budsjett.
Denne protokollen har blitt brukt med elektrofysiologi og bildebehandling møtthods, inkludert patch clamp opptak 8,10,11, polytrode opptak (figur 7), og to-foton bildebehandling 9 (Tall 6 og 8). En mulig fremtidig anvendelse ville være å kombinere disse metoder for målretting fluorescensmerkede celler for elektro opptaket 16..
Nye bildebehandlingsapplikasjoner kan også omfatte 2-D eller 3-D-tidsserier ved hjelp av to-fotonmikroskopi. For eksempel, ved hjelp av bolus-lasting av kalsium indikatorer for å undersøke aktiviteten av hjernestammen neuronal og glial cellepopulasjoner. Som vist i figur 8, et fargestoff oppløsning injisert inn i blodsirkulasjonen gjennom halspulsåren kan brukes til å generere bilder av hjernens blodkar med høy kontrast. Som fluorescens fargestoff fyller microvessel lumen og sprer seg inn i det omgivende vev, kan det brukes ikke bare for å beregne den tilsynelatende oppløste stoff permeabilitet av blod-hjernebarrieren, men også det oppløste stoffet diffusjon coeftiv i hjernevev tre. En hovedårsak for injisering av de fluorescensmerkede oppløste stoffer via halspulsåren, er at fargeløsning kan gå direkte til de microvessels i hjernen uten å gå til hjertet først som i en halevene-injeksjon. Dette fører i det minste to fordeler. Den ene er at fluorescens fargestoff konsentrasjonen i microvessel lumen kan være praktisk talt konstant dersom perfusjon frekvensen er fastsatt til kanylering side. Dette sikrer nøyaktig bestemmelse av blod-hjerne-barrieren permeabilitet. En annen er at hvis et testmiddel er inkludert i perfusatet, vil den gå direkte til blod-hjerne-barrieren uten å bli fortynnet eller i kombinasjon med andre faktorer fra kroppen sirkulasjon.
Nye eksperimenter kan også dra nytte av transgene dyr med genetisk kodet fluorescerende reportere. Dette vil gi den fordelen at fluorescerende prober ikke trenger å bli lastet in situ (med mindre utformingen av eksperimentetsier noe annet), noe som sparer tid og muligens noe som åpner for flere intakte preparater (f.eks kranievindus 17).
Endelig kan eksperimenter gjøres på andre hjerneregioner som mindreverdig oliven eller ansikts motor kjernen. Kunnskap om nevroanatomi og utvikling av spesifikke cellulære populasjoner i en gitt art vil være viktig å få til dette, særlig når anatomiske landemerker kan endres etter hvert som dyrene vokser (Figur 1). Vi håper denne protokollen oppfordrer andre til å studere ventral hjernestrukturer ved hjelp av in vivo elektrofysiologisk og imaging metoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av stipend G12-RR003060 fra NIH / NCRR / RCMI, gi SC1HD068129 fra Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation cbet 0.754.158 og PSC-CUNY 62337-00 40 fra City University of New York.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |