Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Hud og Live-avbildning av Melanoblast Migration

Summary

Vi beskriver disseksjon og ex vivo kultur av muse embryonale hud. Kultursystemet opprettholder en luft-væske-grensesnittet over vevsoverflaten og tillater avbildning på et invertert mikroskop. Melanoblasts, en komponent i utviklings hud, er fluorescensmerkede slik at deres atferd for å bli observert ved hjelp konfokalmikroskopi.

Abstract

Melanoblasts er neural crest avledet forløpere for melanocytter; cellene som er ansvarlige for produksjon av pigment i huden og håret. Melanoblasts migrere gjennom epidermis av embryoet hvor de senere kolonisere utvikle hårsekkene ^1,2. Neural crest celle migrasjon er grundig studert in vitro, men in vivo metoder er fortsatt ikke godt utviklet, særlig i pattedyr systemer. Ett alternativ er å bruke ex vivo organotypic kultur ^3-6. Kultur av muse-embryonale hud krever opprettholdelse av en luft-væske-grensesnittet (ALI) over overflaten av vevet ^3,6. Høyoppløselig live avbildning av mus embryonale huden har blitt hemmet av mangelen på en god metode som ikke bare opprettholder denne ALI men også lar kulturen å bli invertert, og derfor kompatibel med kort arbeidsavstand objektiv og mest confocal mikroskoper. Denne artikkelen beskriver de siste forbedringene til en method som bruker en gass-permeabel membran for å overvinne disse problemer og tillate høy oppløsning confocal avbildning av embryonale hud i ex vivo kultur ^6.. Ved å bruke en melanoblast bestemt Cre-recombinase uttrykke muselinje kombinert med R26YFPR reporter linjen er vi i stand til å fluorescently merke melanoblast befolkningen innenfor disse hud kulturer. Teknikken tillater levende-avbildning av melanoblasts og observasjon av deres atferd og interaksjoner med vevet der de utvikler. Representative resultater er inkludert for å demonstrere evnen til å leve-bilde 6 kulturer i parallell.

Introduction

Tradisjonelt embryonale huden har blitt dyrket ved å dissekere fra mus embryo og montering på et polykarbonat Nuclepore membran. Membranen blir så fløtet på kulturmediet, og dermed opprettholde en luft-væske-grensesnittet over overflaten av det fremkallende tissue ^3,4. Denne teknikken er blitt brukt for å bestemme melanoblast oppførsel ved å feste vevet og vurdering melanoblast fordeling ved hjelp β-galaktosidase som en markør ^7.. Vi har utviklet en metode som gjør at levende-avbildning av fluorescensmerkede melanoblasts i ex vivo hud kultur ^seks. Her beskriver vi metoden i detalj fra disseksjon, å sette opp, for å leve confocal bildebehandling og inkluderer noen nye forbedringer.

Melanoblasts er de embryonale forløpere av melanocytter, cellene som produserer pigment i hår og hud. Oppstår Melanoblasts i neural crest tilstøtende til det nevrale røret på rundt embryonisk dag 9 (E9) i den tredje muse embryo. Deretter de vandrer langs en dorsolaterale svei mellom ektoderm og utviklings somites. På E12.5 flytter de fra dermis til epidermis hvor de sprer og fortsette sin vandring. Den primære hårsekken mønster begynner å danne i epidermis på E14.5 og ved E15.5 melanoblasts er lokalisere til disse folliklene. For en gjennomgang av melanoblast / melanocyte utvikling se Thomas & Erickson (2008) ^1. For å merke melanoblast befolkningen har vi kombinert Tyr :: CREB dyr som uttrykker Cre-recombinase drevet av muse tyrosinase arrangøren ⁸ med R26YFPR dyr som uttrykker gul fluoriserende protein (YFP) betinget fra ROSA26 locus ^ni.

Vi beskriver en metode for å kultur embryonale hud og ta bilder ved hjelp av en invertert konfokal mikroskop. Den er tilpasset formen den opprinnelige metoden beskrevet i Mort et al. (2010) ^6.. ForeliggendeMetoden tillater avbildning i en 6-brønns format og fjerner avhengighet av Nuclepore membraner og på matrigel å støtte kulturen. Istedenfor ved hjelp av en liten blokk med 1% agarose for å stabilisere den embryoniske huden. Fjerne avhengigheten matrigel er viktig, spesielt i situasjoner der responsen fra embryonale huden til løselige vekstfaktorer er fokus for studien. Vår opprinnelige metoden har allerede blitt brukt til å få ny innsikt i melanoblast utvikling ^10-13 og vi forventer at de forbedringene vi beskriver her vil gjøre det mer kraftig som en eksperimentell teknikk spesielt der flere parallelle kulturer er et krav.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer under lisens av det britiske Home Office (prosjekt lisensnummer PPL 60/3785 og 60/4424). En. Forberedelse Merke melanoblasts i utviklings huden ved å kombinere en passende Cre-recombinase uttrykke mus tråd med et fluorescerende reporter mus linje. Tyr :: Crea, Tyr :: CREB 8 og Wnt1 :: Cre 14 har blitt brukt med hell som Cre-uttrykke linjer og R26YFPR ni</su…

Representative Results

Figur 2 viser representative resultater fra en tid forfalle eksperiment ved hjelp av embryonale hud fra Tyr :: CREB x R26YFPR embryoer ved E14.5. 6 embryonale hud kulturer ble fotografert ved konfokal mikroskopi hvert 2 min i 18 timer. Den freeware bildeanalyse programvarepakke ImageJ ble brukt til å analysere oppførselen til YFP-merket melanoblasts i de seks filmene. De melanoblasts var automatisk spores ved hjelp av wrMTrck plugin utviklet av Jesper Søndergaard Pedersen ( <a href="http://w…

Discussion

Vi beskriver en metode for å kultur embryonale hud som er PARTICULARITY mottagelig for live-cell imaging på omvendte confocal mikroskoper. Fremgangsmåten omfatter nylige forbedringer som tillater seks kulturene som skal bli avbildet i parallell og fjerner avhengighet av matrigel og Nuclepore membraner av den opprinnelige metoden ^{til 6.} Den avgjørende forskjell teknisk av lignende teknikker er bruk av en gass-permeabel membran lummox å etablere en luft-væske-grensesnittet, og også til å fungere som et …

Materials

DMEM high glucose	Biochrom AG	F0475	without phenol red
Penicillin	Sigma	P3032
Streptomycin	Sigma	S9137
Fetal calf serum	Hyclone	SV30160.03
Glutamax	Gibco	35050-038
Ethanol	Generic
Live imaging chamber	Custom made
Lummox dishes	Sarstedt	94.6077.410
6-well plate	Greiner Bio-One	657-160
Single edged razor blade	Fisher Scientific	1244-3170
Agarose	Biogene	300-300
Fine pastette	Generic
PBS	Generic
Kebab skewers	Waitrose		Bamboo BBQ skewers 30cm
Toothbrush	Generic
Petri dishes	Greiner Bio-One	633185
Suture thread	Look	SP115	Black silk suture thread