Lazer kaynaklı Arıza Spektroskopisi: Organ Doku Nanopartikülün en Mapping ve Nicelik için Yeni Bir Yaklaşım
Summary
Ince organ ve tümör dokusu üzerinde yapılan lazer kaynaklı arıza spektroskopi başarıyla Gd-tabanlı nanopartikülleri çıkarılacak doğal unsurlar ve yapay enjekte gadolinyum (Gd), tespit. Kimyasal elementlerin Görüntüler 100 mikron ve kantitatif alt mM hassasiyet çözünürlüğü ulaştı. Standart optik mikroskop ile kurulum uyumluluğu aynı biyolojik doku birden fazla görüntü sağlama potansiyelini vurguluyor.
Abstract
Lazer kaynaklı plazma emisyon spektroskopisi biyolojik numunelerin element analizi uygulanmıştır. Lazer kaynaklı arıza Spektroskopisi (LIBS) kemirgen dokuların ince bölümlerinde gerçekleştirilmiştir: böbrekler ve tümör sağlar, örneğin, (i), Na, Ca, Cu, Mg, P ve Fe, vücutta doğal olarak bulunan ve benzeri gibi inorganik elemanlarının tespiti (ii) Si ve Gd, gadolinyum bazlı nanopartiküllerin enjeksiyonundan sonra algılandı. Hayvanlar, parçacıkların damar içine enjeksiyonundan sonra 1-24 saat kurban edilmiştir. Numunenin iki boyutlu tarama, kızılötesi bir lazer ışını bir yanal çözünürlüğü az 100 μ m ile yüzey keşfetmek izin verilen, bir motorlu mikrometrik olarak 3D-sahne kullanılarak gerçekleştirilir. Organ içindeki Gd elementinin kantitatif kimyasal görüntüleri alt mM duyarlılığı ile elde edilmiştir. LIBS herhangi bir labeli olmayan inorganik maddelerin dağılımını incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sunmaktadırng. , Element moleküler veya hücresel: Ayrıca, standart optik mikroskop ile kurulum uyumluluğu tepkisinin farklı tipleri ile aynı biyolojik doku birden fazla görüntü sağlama potansiyelini vurguluyor.
Introduction
Biyolojik uygulamalarda nanopartiküllerinin büyük gelişme biyolojik örneklerindeki miktar ve görüntüleme için analitik teknikler paralel iyileşme istedi. Genellikle organlarda nanopartiküllerin algılama ve eşleme floresan veya konfokal mikroskopi ile yapılır. Ne yazık ki, bu yöntem özellikle hidrofobik özellikleri nedeniyle çok küçük nano partikül için, nanopartiküllerin biyodağılımı değiştirmek için, bir yakın kızıl ötesi boya ile nanopartiküllerin etiketleme gerektirir. Etiketli nanopartiküller ve özellikle çok küçük nano partiküller (boyut <10 nm) tespiti, ve böylece bütün vücut ölçekli değil, aynı zamanda, doku ve hücre seviyelerde biyo-dağılımının etkileşebilir. Herhangi bir etiketleme olmadan nanopartıküllerıni tespit edebiliyoruz yeni cihazların geliştirilmesi davranışları ve kinetik çalışmaları için yeni olanaklar sunuyor. Ayrıca, bu tür beyin demir ve bakır gibi iz elementlerinin rolü bir hastalıklarıBöyle Alzheimer 1, Menkes 2,3, veya Wilson 4 olarak d nörodejeneratif hastalıklar dokularındaki bu unsurları incelemek ve lokalize ilgi öneririz.
Çeşitli teknikler farklı malzemelerin elemental eşleme veya mikroanaliz temin etmek üzere kullanılmıştır. 2006 yılında yayınladıkları yorumu kağıt, R. Lobinski vd. Biyolojik ortamda, analitik bilimler 5 için en zorlu ortamlarda birinde element mikroanalizi için mevcut standart tekniklerin bir bakış sağladı. Element konsantrasyonu yeterli ise bir transmisyon elektron mikroskobu enerji dispersif X-ışını mikroanalizi oluşur elektron mikroprob, çok sayıda çalışma uygulanabilir (> 100-1.000 ug / g). Alt algılama sınırlarını ulaşmak için aşağıdaki teknikler kullanılır olmuştur:
- kullanılarak iyon demeti mikroprop parçacık kaynaklı X-ışını emisyonu μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
- synradyasyon mikroanaliz μ-SXRF chrotron (0.1-1 ug / g) 7
- ikincil iyon kütle spektrometrisi SIMS (0.1 ug / g), 8
- lazer ablasyon indüktif (aşağı 0.01 ug / g) LA-ICP-MS 9,10 kütle spektrometresi birleştiğinde
Lobinski et al çıkarılan, Tablo 1 de gösterildiği gibi, yukarıda belirtilen teknikler mikrometrik çözünürlüğü sağlar.
Seri 2D soruşturmaların 3D rekonstrüksiyon da derin dokulara 11 yeniden inşası için teklif olabilir. Ancak, tüm cihazları ve sistemlerinin her ikisi de son derece pahalı ekipman orta nitelikli profesyoneller, ve uzun süreli deneyler (bir μ-SXRF için x 100 mikron 100 mikron ve LA-ICP-MS için x 10 mm 10 mm için genellikle fazla 4 saat gerektirir ) 12. Toplamda, bu gereksinimleri, element mikro çok kısıtlayıcı ve geleneksel optik görüntüleme sistemleri ile uyumlu halefloresan mikroskobu ya da doğrusal olmayan mikroskopisi. Burada bahsettiğimiz bir başka nokta kantitatif ölçüm yeteneği hala oldukça sınırlıdır ve matriks uyumlu laboratuvar standartları bulunmasına bağlıdır olmasıdır. Sanayi süreçleri, jeoloji, biyoloji ve uygulamalar diğer alanlarda element mikroanalizi kullanımının daha da yaygınlaştırılması önemli kavramsal ve teknolojik atılımlar üretecektir.
Mevcut yazının amacı, geleneksel optik mikroskop ile tam uyumlu bir masaüstü enstrümantasyon ile biyolojik dokular kantitatif element haritalama (veya element mikroanalizi) için çözümler önermektir. Yaklaşımımız lazer kaynaklı arıza spektroskopisi (LIBS teknolojisi) dayanmaktadır. LIBS olarak, lazer darbeli malzemenin bozulmasını ve kıvılcım oluşturmak için ilgi numune üzerinde odaklanmıştır. Plazmada yayılan radyasyonu atom, daha sonra, bir spektrometre ile analiz edilir Elemental konsantrasyonları 13,14 önceden yapılan kalibrasyon ölçümleri ile alınabilir. LIBS avantajları, kompakt, çok temel numune hazırlama, numune ile temas anında tepki olarak ve tam anlamıyla (mikro) yüzey analizi yokluğu (hemen hemen tüm unsurları için ug / g) duyarlılığı içerir. Doku lazer ablasyon ince birlikte mikrogram / g aralığında 15,16 duyarlılığı yüksek uzaysal çözünürlüğü ile haritaları gerçekleştirmek için kontrol edilmelidir Ancak, doku kimyasal görüntüleme uygulaması zorlu kalır.
Bu tür bir çözüm sayesinde, izleyici ya da etiketleme ajanlar adjunction biyolojik dokulardaki kendi doğal ortamında doğrudan inorganik elementler tespit sağlar ki, gerekli değildir. Laboratuvarımızda geliştirilen KIBS enstrüman sağlar 0.1 mm 16, eşdeğer 35 ug / g altında Gd için tahmini bir hassasiyet ile 100 mikron aşağı bir akım çözünürlüğü sunuyorbüyük numunelerin eşleme (> 1 cm2), 30 dakika içinde. Buna ek olarak, ev yapımı yazılım veri alma ve sömürü kolaylaştırır. Bu alet gadolinyumun doku dağılımı, ilk tespit etmek ve ölçmek için kullanılır (Gd) bazlı nanopartiküller 17 – küçük hayvanlardan böbrekler ve tümör örneklerinde 18, 1 parçacıkların damar içine enjeksiyonundan sonra 24 saat için (boyut <5 nm) . Örneğin Fe, Ca, Na ve P gibi içsel bir biyolojik doku içerdiği inorganik elementler, aynı zamanda tespit edilebilir ve görüntülü edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolojik numune uygulandığında bu teknik, farklı organlarda enjekte Gd bazlı nano parçacıklardan Gd ve Si haritalama ve miktarının, örneğin, kimyasal görüntüleme sağlar. Ana kritik ayarlarından, lazer özellikleri (dalga boyu, darbe enerjisi, odaklama ve kararlılık) kontrol hassas ve ince doku ablasyonu (örneğin, eşleme çözünürlük) için hem de hassasiyeti için çok önemlidir. Yüksek enerji çalışmak daha iyi bir hassasiyet sağlar ama maalesef bozulmuş uzaysal çözün…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle Labex-Imust finansal destek için minnettarım.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
