Denne protokollen beskriver ekstracellulære opptak av handlings potensielle responser avfyrt av labellar smaks nevroner i Drosophila.
Det perifere smak respons av insekter kan være kraftfullt undersøkt med elektrofysiologiske teknikker. Metoden som beskrives her tillater forskeren å måle gustatory svar direkte og kvantitativt, som gjenspeiler den sanseinntrykk at insektet nervesystemet mottar fra smaks stimuli i omgivelsene. Denne protokollen skisserer alle viktige skritt i å utføre denne teknikken. De kritiske trinnene i å sette sammen en elektrofysiologi rigg, som for eksempel valg av nødvendig utstyr og et egnet miljø for opptak, er avgrenset. Vi beskriver også hvordan å forberede for opptak ved å gjøre riktige referanse og opptak elektroder, og smaksmiddel løsninger. Vi beskriver i detalj den metode som brukes for fremstilling av insekt ved innsetting av en glassreferanseelektrode i fly for å immobilisere snabel. Vi viser spor av de elektriske impulser avfyrt av smaksnerveceller i respons til et sukker og en bitter forbindelse. Aspekter ved protokollen er technically utfordrende og vi har en omfattende beskrivelse av noen vanlige tekniske utfordringer som kan oppstå, for eksempel manglende signal eller støy i systemet, og mulige løsninger. Teknikken har begrensninger, slik som manglende evne til å levere timelig komplekse stimuli, observerer bakgrunn avfyring umiddelbart før stimulus levering, eller bruke vannuløselige smaksforbindelser beleilig. Til tross for disse begrensningene, er denne teknikken (inkludert mindre variasjoner referert i protokollen) en standard, bredt akseptert prosedyre for opptak Drosophila nevrale responser å smake forbindelser.
Smakssansen gjør at et insekt å oppdage et stort spekter av løselige kjemikalier og spiller en viktig rolle i aksept av et næringsrikt stoff, eller avvisning av en skadelig eller giftig ett. Smak er også antatt å spille en rolle i mate valg, gjennom påvisning av feromoner 1-5. Disse viktige og ulike funksjoner har gjort insekt smak systemet en overbevisende målet for etterforskningen i hvordan sansesystemer sette miljømessige signaler i relevante atferds utganger.
Den primære enhet av Drosophila melanogaster smak system er smaken hår, eller sensillum. Molekyler angi sensillum via en pore på spissen sin 2,6. Sensilla er funnet på labellum, bena, vingen margin, og svelget seks. På labellum, er antallet og plasseringen av sensilla stereotyp. Det er tre klasser av morfologiske sensilla basert på lengde: den lange (L), middels (I) og korte (S ) Sensilla 7,8. Hver sensillum inneholder enten to (I-type) eller fire (L-og S-type) gustatory reseptor nevroner (GRNs) 9. Ulike GRNs svare på ulike kategorier av smaks stimuli: bitter, sukker, salt og osmolaritet 7,10 og uttrykke ulike undergrupper av gustatory reseptorer 8,11-13. Bare jeg og S-type sensilla inneholde bitre-responsive GRNs 8,10. Den GRNs prosjektet til subesophageal ganglion (SOG) og deres aktivering ved smaks molekyler blir videresendt til høyere sentralnervesystemet for dekoding, noe som resulterer i en atferdsmessig respons 6.. Den relativt lite antall nerveceller og amenability til molekylær og atferdsanalyse gjør Drosophila smak systemet en utmerket modell for etterforskningen av gustatory systemer generelt. Den relative enkle som systemet kan manipuleres via genetisk mutasjon eller Gal4-UAS uttrykk systemet fungerer også som et verdifullt verktøy 14,15.
ontent "> Fordi disse sensilla stikker ut fra overflaten av labellum, de er utmerkede mål for elektrofysiologi. avfyring av GRNs kan overvåkes ved bruk av ekstracellulære opptak. Historisk sett har side-veggen opptaksmetode, som bruker en glasselektrode innsatt i sensillum å ta opp neuronal aktivitet, 26 har vært i bruk. Imidlertid er denne fremgangsmåte er teknisk vanskelig å utføre, og det er vanskelig å ta for lang tid fra hvert preparat. Spissen-opptaksmetoden, som måler responsen av nervecellene med en elektrode som samtidig leverer et smaksmiddel, siden blitt metoden for valg 9,16. det har blitt anvendt for å undersøke smak system av Drosophila melanogaster 8,10,17,18, samt en rekke andre insektarter 19-23. har blitt betydelig lettere ved utviklingen av tastePROBE forsterkeren, som overvant én av de store ulempene ved tip-opptaksmetoden ved å kompensere forden store potensialforskjell mellom referanseelektroden og den insekt sensillum, slik at grn aksjonspotensialer som skal tas opp uten overdreven forsterkning eller filtrering 24. En annen viktig utvikling var bruken av tricholine citrate ettersom opptakselektrolytt 25. TCC undertrykker svar fra osmolariteten følsomme GRN og stimulerer ikke salt-følsomme GRN, gjør responser generert av bitter og sukker Tastants mye lettere å analysere 25.Her beskriver vi hvordan tips innspillingen av Drosophila labellar sensilla er for tiden utføres i Carlson laboratoriet. Denne protokollen vil forklare hvordan å etablere en egnet elektrofysiologi rigg, hvordan å forberede fly, og hvordan du utfører smaks innspillinger. Vi presenterer også noen representative data innhentet ved opptak fra undergrupper av Drosophila sensilla, samt noen vanlige problemer og mulige løsninger som kan oppstå ved bruk av denneteknikk.
Labellar sensilla varierer i den enkle opptak på grunn av forskjeller i morfologi og anatomisk organisasjon. Noen ganger kan en sensillum ikke svare på eventuelle Tastants, selv en som er kjent for å lokke fram en positiv respons. Hvor ofte dette skjer varierer avhengig sensillum type. L sensilla er mest konsistent følsomme og er relativt lett å åpne på grunn av deres lengde. Generelt, S sensilla er konsekvent responsive, men deres korte lengde og posisjon på labellum får god kontakt utfordrende. I sensilla kan…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en NRSA predoctoral stipend 1F31DC012985 (til RD) og ved NIH tilskudd til JC
Vi ønsker å takke dr. Linnea Weiss for nyttige kommentarer til manuskriptet, Dr. Ryan Joseph for hjelp kompilere tall, og Dr. Frederic Marion-Poll for nyttig teknisk rådgivning. Vi ønsker også å erkjenne de nyttige kommentarer av fire anmeldelser.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |