En strategi for Sensitive, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Summary

Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Ved hjelp av normal-faset væskekromatografi koblet til høy-oppløsningsmassespektroskopi med polaritet svitsjing og en hurtig arbeidssyklus beskrives en protokoll for å analysere den polare metabolske Sammensetningen av det biologiske materiale med høy følsomhet, nøyaktighet og oppløsning.

Abstract

Metabolitt profilering har vært en verdifull ressurs i studiet av stoffskiftet i helse og sykdom. Men dagens plattformer har ulike begrensende faktorer, som for eksempel arbeidskrevende prøveforberedelser, lave deteksjonsgrenser, treg skannehastigheter, intensiv metode optimalisering for hver metabolitt, og manglende evne til å måle både positivt og negativt ladede ioner i enkelt eksperimenter. Derfor kan en roman metabolomics protokoll avansere metabolomics studier. Amid-baserte hydrofil kromatografi gjør polar metabolitt analyse uten kjemisk derivatisering. Høyoppløsnings MS ved hjelp av Q-Exactive (QE-MS) har forbedret ione-optikk, økt skannehastighet (256 msek ved oppløsning 70000), og har evnen til å utføre positiv / negativ svitsjing. Ved hjelp av en kald metanolekstraksjon strategi, og kobling av et amid kolonne med QE-MS gir robust deteksjon av 168 målrettede polare metabolitter og tusenvis av ekstra funksjoner samtidig. Daten foredling er utført med kommersielt tilgjengelig programvare på en svært effektiv måte, og ukjente egenskaper trukket ut fra massespektra kan spørres i databaser.

Introduction

Metabolomics, definert som et eksperiment som måler flere metabolitter samtidig, har vært et område med stor interesse. Metabolomics gir en direkte avlesning av molekylær fysiologi og har gitt innsikt i utvikling og sykdom som kreft ^1-4. Nukleær magnetisk resonans (NMR) og gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er blant de mest brukte instrument ^5-9. NMR, spesielt har vært brukt i forsøk fluks ettersom tunge isotop merkede forbindelser, for eksempel ¹³ C-merkede metabolitter, er NMR-aktive ^10,11. Men denne strategien krever relativt høy sample renhet og stor prøvemengde, noe som begrenser dets applikasjoner i metabolomics. I mellomtiden, data samlet inn fra NMR trenger intensiv analyse og sammensatte oppdrag av komplekse NMR spektra er vanskelig. GC-MS har vært mye brukt for polare metabolitter og lipid-studier, men det krever volatile sammensetninds og derfor ofte derivatisering av metabolitter, som noen ganger innebærer kompleks kjemi som kan være tidkrevende og introduserer eksperimentell støy.

Væskekromatografi (LC) som er koplet til trippel kvadrupol massespektrometer bruker den første kvadrupol for å velge de intakte moder ioner, som deretter fragmentert i den andre kvadrupol, mens den tredje kvadrupol brukes til å velge karakteristiske fragmenter eller datterioner. Denne metoden, som registrerer overgangen fra moder ioner til spesifikke datterioner, er betegnet multiple reaksjons overvåkning (MRM). MRM er en veldig følsom, bestemt, og robust metode for både små molekyl og protein kvantifisering ^12-15,21. Men gjør MRM har sine begrensninger. For å oppnå høy spesifisitet en MRM metode må bygges for hver metabolitt. Denne metoden består i å identifisere et bestemt fragment og tilsvarende optimert kollisjonsenergi, noe som krever forhånds kjennskap til properties av metabolitter av interesse, for eksempel kjemisk struktur informasjon. Derfor, med visse unntak som involverer den nøytrale tap av vanlige fragmenter, er det ikke mulig å identifisere ukjente metabolitter med denne metoden.

I de senere årene, har høy oppløsning massespektrometri (HRMS) instrumenter blitt utgitt, slik som LTQ-Orbitrap og Exactive serien, QuanTof, og TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS kan tilveiebringe en masse for å lade forholdet (m / z) av intakte ioner innenfor en feil på noen få ppm. Derfor kan en HRMS instrument som opereres av lokalisering av forløper-ioner (dvs. fullt scan modus) få direkte strukturell informasjon fra eksakt masse og den resulterende elementsammensetningen av analytten, og denne informasjonen kan benyttes til å identifisere mulige metabolitter. Faktisk, kan all informasjon om en forbindelse oppnås med en nøyaktig masse, opp til nivået av strukturelle isomerer. Dessuten er en helscan-metoden krever ikke kjennskap til metabolitter og krever ikke fremgangsmåten optimalisering. Dessuten, siden alle ioner med m / z faller ned i frekvensområde kan analyseres, har HRMS tilnærmet ubegrenset kapasitet med hensyn til antallet av metabolitter som kan kvantifiseres i et enkelt løp i forhold til MRM-metoden. HRMS er også sammenlignes med en trippel kvadrupol MRM i kvantitativ kapasitet på grunn av den korte driftssyklus resulterer i en tilsvarende antall datapunkter som kan oppnås i en full MS skanne. Derfor HRMS gir en alternativ tilnærming til kvantitative metabolomics. Nylig har en forbedret versjon av HRMS betegnet Q-Exactive massespektrometri (QE-MS) kan betjenes under veksling mellom positive og negative moduser med tilstrekkelig hurtig syklustider i en enkelt fremgangsmåte, som ekspanderer deteksjonsområdet ^19.. Her beskriver vi vår metabolomics strategi ved hjelp av QE-MS.

Protocol

En. Utarbeidelse av LC-MS-reagenser, Etablering av en Kromatografi Method, og Etablering av Instrument Operating Procedures

1. Utarbeidelse av LC Løse
   1. Forbered 500 ml mobilfaser. A er 20 mM ammoniumacetat og 15 mM ammonium-hydroksid i 3% acetonitril / vann, endelig pH 9,0; og B er 100% acetonitril.
   2. Løst cap flasken, legg den i et vannbad sonicator, og sonicate i 10 min uten ekstra oppvarming. (Dette trinn er å sikre at alle de ammoniumsalter oppløses fullstendig og at det ikke er noen gjen…

Representative Results

Nøyaktigheten av metabolomics data svært avhengig av LC-QE-MS instrument ytelse. For å vurdere om instrumentet fungerer i god stand, og hvorvidt den metode som er benyttet er riktig, er flere kjent metabolitt LC topper ekstrahert fra den totale ione-kromatografi (TIC), som vist i figur 1.. Polare metabolitter, inkludert aminosyrer, glykolysen mellom , TCA mellomprodukter, nukleotider, vitaminer, ATP, NADP ⁺ og så videre har god oppbevaring på kolonne og god peak former i amid kolonne und…

Discussion

De mest kritiske trinn for vellykket metabolitt profilering i celler ved hjelp av denne protokoll er: 1) kontroll av vekstmedium og forsiktig ekstraksjon av cellene; 2) justere LC metode basert på MS-metoden oppsett for å sikre at det er nok (vanligvis minst 10) datapunkter over en topp for kvantifisering; 3) gjør en lav masse kalibrering før du kjører prøver; 4) å injisere ikke mer enn 5 ml for å unngå retensjonstid skiftende og maksimal utvidelse forårsaket av vann; og 5) å fremstille og drive ut prøver fo…

Materials

Positive calibration mix	Thermo Scientific	#88323	It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix	Thermo Scientific	#88324	Store at 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert	Fisher Scientific	#1303200	This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column	Waters	#186004860	Guard column is recommend to increase column lifetime.