Juxtasomal biocytin Mærkning at studere strukturen-funktionen forholdet mellem individuelle corticalneuroner
Summary
For at forstå strukturen af neuronale netværk, funktionelle og morfologiske karakterisering af individuelle neuroner er en nødvendighed. Her viser vi juxtasomal biocytin mærkning, som gør det muligt for elektrofysiologiske målinger i den ekstracellulære konfiguration, og alligevel bevare evnen til intracellulært mærke neuron til post hoc genopbygning af dendritiske og axonal arkitektur.
Abstract
Hjernebarken er præget af flere lag og mange forskellige celletyper, der sammen som et netværk er ansvarlige for mange højere kognitive funktioner, herunder beslutningstagning, sensorisk-styrede adfærd eller hukommelse. For at forstå hvordan sådanne indviklede neuronale netværk udføre sådanne opgaver, et afgørende skridt er at bestemme funktionen (eller elektrisk aktivitet) af de enkelte celletyper inden for netværket, fortrinsvis når dyret udfører en relevant kognitiv opgave. Derudover er det ligeledes vigtigt at bestemme den anatomiske struktur af nettet og den morfologiske arkitektur af de enkelte neuroner til at tillade reverse engineering kortikale netværk. Tekniske gennembrud til rådighed i dag tillade optagelse cellulære aktivitet i vågen, opfører dyrene med værdifuld mulighed for post hoc identificere de optagede neuroner. Her vil vi demonstrere juxtasomal biocytin mærkning teknik, som indebærer optagelse handling potential spiking i det ekstracellulære (eller løs-patch) konfiguration ved hjælp af konventionelle patch pipetter. Den juxtasomal optagelse konfiguration er relativt stabil og anvendelse på tværs af adfærdsmæssige forhold, herunder bedøvet, bedøvet, vågen hoved-faste, og selv i frit bevægelige dyr. Således er denne metode tillader forbinder celletypespecifik handling potentiale spiking under dyrs adfærd til genopbygning af de enkelte neuroner og i sidste ende, det hele kortikale mikrokredsløb. I denne video manuskript, viser vi, hvordan enkelte neuroner i juxtasomal konfiguration kan mærkes med biocytin i urethan-bedøvede rotte til post-hoc identifikation og morfologisk rekonstruktion.
Introduction
Neuronale netværk består af flere celletyper, karakteriseret ved meget specifikke morfologiske og fysiologiske egenskaber 1-7. Som en konsekvens, individuelle celletyper udføre specialiserede opgaver inden for netværket (se f.eks Gentet et al. 8 og Burgalossi et al. 9). Vi er kun lige begyndt at forstå celletype-specifikke funktioner på tværs af neuronale netværk og meget er stadig at blive opdaget. Til dette formål er der mange laboratorier gennemførelse eksperimentelle metoder, der tillader analyse af morfologiske egenskaber af den samme neuronale population hvorfra fysiologiske parametre er opnået 1,10-15. Her viser vi juxtasomal mærkningsteknik 16,17 som involverer elektrofysiologiske målinger ved anvendelse af konventionelle patch pipetter i det ekstracellulære (og dermed noninvasive)-konfiguration i kombination med elektroporation af den optagede neuron med biocytin. Denstor fordel ved denne fremgangsmåde er, at ikke-invasiv karakter sikrer, at virkningspotentiale spiking af individuelle neuroner er optaget uden at ændre (fx dialyse) det intracellulære indhold af cellen. Efterfulgt af elektroporation, giver juxtasomal tilgang mulighed for post hoc identifikation og genopbygning celle til at linke funktion (fysiologi) til struktur (morfologi). Typisk morfologisk rekonstruktion indebærer genopbygning af dendritiske og axonal morfologi, som kan udvides til kvantificering af rygsøjlen og / eller bouton tætheder eller endda genopbygningen af neuronal morfologi på nanometer opløsning ved hjælp af elektronmikroskopi. Den juxtasomal optagelse teknik kan bruges til in vivo optagelser af forskellige celletyper tværs kortikale lag eller i sub-kortikale områder i en række arter, selv om de fleste undersøgelser har anvendt teknikken i små gnavere såsom mus eller rotter. Vores forskning er fokuseret på optagelse og mærkning neuronerfra rotte primære somatosensoriske cortex (S1) og involverer visuel identifikation af indspillede neuroner 18, at dendritiske rekonstruktioner i kombination med præcis registrering på en standardiseret referenceramme reverse engineering kortikale netværk 4,19 og detaljeret rekonstruktion af axonal arkitektur at karakterisere celletype-specifikke lokale og langtrækkende projektion målene 20.
Sammenlignet med alternative in vivo optagelse teknikker (intracellulære eller hel-celle), juxtasomal optagelser er relativt stabile og kan derfor anvendes på tværs af adfærdsmæssige tilstande herunder bedøvet 21,22, sederet 14, vågen head-fast 23 eller endda frit bevægelige dyr 9 . Her viser vi juxtasomal mærkning i S1 af en urethan-bedøvede rotte, selvom vi understrege den generelle anvendelighed af denne teknik til mange præparater af valg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den juxtasomal metode gør det muligt at optage i vivo aktionspotentialets spiking fra enkelte enheder på tværs af adfærdsmæssige forhold (bedøvede, vågen hoved fast eller frit bevægelse) med mulighed for biocytin-mærkning af indspillet neuron til post hoc celletype klassificering og / eller 3D-rekonstruktion. Den største fordel er at opnå fysiologiske parametre i det ekstracellulære (og dermed noninvasive)-konfiguration, men alligevel være i stand til at mærke neuron intracellulært med b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Profs. Huibert Mansvelder og Bert Sakmann for omfattende støtte, Dr. Marcel Oberlaender for frugtbare diskussioner og give neuronal opsporing, og Brendan Lodder til teknisk bistand. Data blev erhvervet ved hjælp af ntrode VI for LabView, generøst leveres af R. Bruno (Columbia Univ.., NY, USA). Denne forskning blev støttet af Max Planck Society og Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (finansieret af det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF, FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Center for Neurogenomics og kognitiv forskning (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), midler til CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 og ENC-Netværk # p3-c3) og VU University Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
