Juxtasomal Biocytin Merking for å studere strukturen-funksjon forholdet mellom enkelt kortikale nevroner

Summary

For å forstå strukturen av nevrale nettverk, er funksjonelle og morfologiske karakterisering av individuelle nevroner en nødvendighet. Her viser vi juxtasomal biocytin merking, noe som gjør at elektrofysiologiske opptak i den ekstracellulære konfigurasjon, men har likevel beholdt evnen til intracellulært merke nervecellen for post hoc rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal arkitektur.

Abstract

Hjernebarken er preget av flere lag og mange forskjellige celletyper som sammen som et nettverk er ansvarlig for mange høyere kognitive funksjoner, inkludert beslutningstaking, sensorisk-guidet atferd eller minne. For å forstå hvordan slike intrikate nevrale nettverk utføre slike oppgaver, er et viktig skritt for å bestemme funksjonen (eller elektriske aktivitet) av enkelte celletyper i nettverket, fortrinnsvis når dyret utfører en relevant kognitiv oppgave. I tillegg er det like viktig å fastslå den anatomiske strukturen i nettverket og den morfologiske arkitekturen i de enkelte nerveceller til å tillate reverse engineering kortikale nettverk. Tekniske gjennombrudd tilgjengelig i dag la innspillingen cellulær aktivitet i våken, oppfører dyr med verdifull mulighet for post hoc identifisere de registrerte nevroner. Her demonstrerer vi juxtasomal biocytin merking teknikk, som innebærer innspilling handling potenal spiking i den ekstracellulære (eller løs-patch) konfigurasjon ved hjelp av konvensjonelle patch pipetter. Den juxtasomal opptaksoppsettet er relativt stabil og gjelder på tvers av atferdsvilkår, herunder bedøvet, bedøvet, våken head-fast, og selv i fritt bevegelige dyr. Dermed gir denne metoden knytte celle-type spesifikke aksjonspotensial spiking under dyrs atferd til gjenoppbygging av de enkelte nevroner og til slutt, hele kortikale mikrokretsen. I denne videoen manuskript, viser vi hvordan enkelte nevroner i juxtasomal konfigurasjon kan merkes med biocytin i uretan-bedøvet rotte for post hoc identifisering og morfologisk rekonstruksjon.

Introduction

Nevrale nettverk består av flere celletyper, karakterisert ved en svært spesifikke morfologiske og fysiologiske egenskaper ^1-7. Som en konsekvens av de enkelte celletyper utføre spesielle oppgaver innenfor nettverket (se f.eks Gentet et al. ⁸ og Burgalossi et al. ^9). Vi er bare begynnelsen for å forstå celletypespesifikke funksjoner på tvers av nevrale nettverk og mye er fortsatt å bli oppdaget. For å oppnå dette, er mange laboratorier implementere eksperimentelle tilnærminger som tillater analyse av morfologiske egenskaper av samme neuronal populasjon som fysiologiske parametere er blitt oppnådd ^1,10-15. Her demonstrerer vi juxtasomal merking teknikk ^16,17 som innebærer elektrofysiologiske opptak ved hjelp av konvensjonelle patch pipetter i den ekstracellulære (altså ikke-invasiv) konfigurasjon i kombinasjon med elektroporering av den innspilte nevron med biocytin. Denstor fordel ved denne tilnærmingen er at den ikke-invasiv karakter sikrer at aksjonspotensial spiking av individuelle nevroner er ført uten å forandre (f.eks dialysering) det intracellulære innholdet av cellen. Etterfulgt av elektroporering, gir juxtasomal tilnærming muligheten av post hoc cellen identifisering og gjenoppbygging å knytte funksjon (fysiologi) til struktur (morfologi). Vanligvis innebærer morfologiske rekonstruksjon rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal morfologi som kan utvides til kvantifisering av rygg-og / eller Bouton tettheter eller rekonstruksjon av neuronal morfologi ved nanometer oppløsning ved hjelp av elektronmikroskopi. Den juxtasomal opptaksteknikk kan benyttes til in vivo opptak av forskjellige celle-typer på tvers av kortikale lag eller i sub-kortikal områder av forskjellig art, selv om de fleste studier har anvendt teknikk i små gnagere som mus eller rotter. Vår forskning er fokusert på innspillingen og merking nevronerfra rotte primære somatosensoriske cortex (S1) og innebærer visuell identifisering av innspilte nevroner ^18, til dendrittiske rekonstruksjoner i kombinasjon med presis registrering i et standardisert referanseramme reverse engineering kortikale nettverk ^4,19 og detaljert rekonstruksjon av aksonal arkitektur for å karakterisere celletype-spesifikke lokale og langtrekkende projeksjon mål ^20.

Sammenlignet med alternative in vivo opptaksteknikker (intracellulære eller hel-celle), juxtasomal opptakene er relativt stabil, og kan derfor brukes på tvers av atferds stater inkludert bedøvet ^21,22, bedøvet ^14, våken head-fast ^23, eller til og med fritt-bevegelige dyr ⁹ . Her viser vi juxtasomal merking i S1 av en uretan-bedøvet rotte, selv om vi understreke den generelle anvendelsen av denne teknikken til mange forberedelser av valg.

Protocol

En. Utarbeidelse av Animal Alle eksperimentelle prosedyrer er utført i samsvar med nederlandsk lov og etter evaluering av en lokal etisk komité ved VU University Amsterdam, Nederland. Anesthetize en Wistar-rotte (P25-P45, ♂ / ♀) med isofluran (2-3% i oksygen) og deretter med uretan (20% i 0,9% NaCl, 1,6 til 1,7 g / kg) ved intraperitonal injeksjon. Vurdere dybden av anestesi ved å overvåke klype tilbaketrekking, øyelokk reflekser, og vibrissae bevegelser. Admini…

Representative Results

Detaljert kunnskap om 3D-struktur av individuelle nevroner er avgjørende for å belyse organisatoriske prinsipper for nevrale nettverk. Vår metode innebærer en rørledning for å oppnå høy kvalitet biocytin merking fra en in vivo forberedelse, og dermed lar post hoc nevronale klassifisering og detaljert rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal arkitektur av enkeltnerveceller i høy oppløsning. Avhengig av kvaliteten av juxtasomal merking, blir neuroner utvinnes med forskjellige DAB-intensiteter …

Discussion

Den juxtasomal metoden gjør opptak i vivo aksjonspotensial spiking fra enkle enheter på tvers av atferds forhold (bedøvet, våken head-fast eller fritt bevegelige) med mulighet for biocytin-merking innspilt nevron for post hoc celletype klassifisering og / eller 3D-rekonstruksjon. Den store fordelen er å få fysiologiske parametre i den ekstracellulære (altså ikke-invasiv) konfigurasjon og likevel være i stand til å merke nervecellen intracellulært med biocytin ^16,17,32. I tillegg t…

Materials

SM-6 control system	Luigs & Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 amplifier	Neuralynx
Axoclamp-2B amplifier	Axon Instruments
Osada model EXL-M40	Osada, inc.
Piezoelectric device	Physik Instrumente	PL140.10
Labview	National Instruments, Austin, TX, USA
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA
(Labview acq. software)
Sugi absorbent swabs	Kettenbach	30601
Cytochrome C from equine heart	Sigma	C2506
Catalase from bovine liver	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethane	Sigma	U2500
Isoflurane	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaine	Sigma	L5647
Simplex rapid dental cement	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Analytical grade glycerol	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072