Summary
在这里,我们展示了使用荧光染料的Alexa耦合到α-银环蛇毒素测定GABA A受体表面的定位和内吞作用的海马神经元。通过采用轴承结构结合α-银环蛇毒素,可以实现质膜蛋白的内吞贩运分析短外标签。
Abstract
这是越来越明显的神经递质受体,包括离子型GABA A受体(GABAAR),表现出高度动态的贩运和细胞表面的流动性1-7。为了研究受体细胞表面的定位和内吞作用,这里所描述的技术结合使用荧光α-银环蛇毒素与细胞表达含有α-银环蛇毒素(BGT)结合位点(BBS)的结构。在BBS(WRYYESSLEPYPD)是基于肌肉烟碱乙酰胆碱受体,其结合BGT以高亲和力8,9的α亚基。注册成立的BBS站点允许表面定位和受体插入或移除与应用外源性荧光BGT的测量,如以前在GABAA和GABAB代谢的跟踪受体2,10描述。除了 信息的网站,我们氨基酸4与5的成熟GABAAR亚单位通过标准米之间插入一个pH敏感的绿色荧光蛋白(pHGFP 11)olecular生物学和PCR克隆策略(参见图1)12。 BBS的是3'的pH值敏感的GFP报告,由13个氨基酸丙氨酸/脯氨酸接头隔开。对贩运这一出版物是基于固定样本中描述的研究中,pHGFP作为总的记者标记GABAAR亚单位蛋白水平,使BGT正常化标记受体的人口占总人口的受体。这最大限度地减少细胞与细胞的标记GABAAR亚基的较高或较低的基线表达所得BGT染色信号的变异性。此外,pHGFP标签可方便识别构建表达细胞的活的或固定成像实验。
Introduction
利用荧光再加α-银环蛇毒素研究受体定 位和动态是率先在烟碱乙酰胆碱受体13-15,毒素的内源靶的研究。随后,最小BGT结合肽(BBS)的掺入已被用于研究贩卖既兴奋性和抑制性配体门控离子通道和G蛋白偶联受体2,10,16-21的。本次论坛为基础的技术提供的优势,用于贩运研究,如表面生物素的方法,活细胞的抗体标记的抗体与细胞外抗原表位,和光漂白(FRAP)后荧光恢复其他方法。在细胞表面生物素游离胺的共价修饰,以影响细胞活性的潜力。基于抗体的研究常常受到阻碍表面抗原簇或封盖,它可以改变拐卖事件。由于对FRAP S中的漂白步骤tudies,一个重要的问题是损害底层的细胞结构。一个额外的优点是,信息标记的构建体也可用于生化方法学与生物素偶联银环蛇毒素对驴受体贩卖。这种技术是很容易适用于细胞系和原代细胞。对于在细胞表达烟碱乙酰胆碱(胆碱)受体的使用,胆碱受体拮抗剂筒箭毒碱,必须使用整个协议所指示的。对未转染的细胞在缺乏筒箭毒碱的执行一个简单的表面BGT标签(等同于内吞协议T = 0的时间点),将提供内源性胆碱受体的证据。
使用这种技术的一个重要的考虑因素是BBS的适当的插入,使得它存在于当目的蛋白被递送到质膜的细胞外的位置。例如,GABAAR亚基的N-末端结构域TRAF期间驻留在囊泡腔ficking并成为细胞外质膜受体插入后,使细胞表面的受体和其从细胞表面通过内吞事件去除的评估特异性标记。之前我们已经表明,除了GFP,myc和或BBS的表位GABAAR亚基这个领域在功能上保持沉默。标准控件应该执行,以确保标签的蛋白的表达水平相似,以不加标记的构建物,它适当地本地化的,并且它不影响受体的功能。转结构的这一特点也将有助于在故障排除过度担忧。
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Protocol
下面描述的所有协议都是按照IACUC和匹兹堡大学医学院的内部评级机构审查委员会。
1。海马神经细胞在组织培养罩的准备
注意:使用无菌技术和试剂整个协议1。
- 制备聚-D-赖氨酸(0.1 mg / ml的H 2 O)涂覆的玻璃盖玻片上作为底物的神经元的培养。
- 将每个3.5厘米组织培养皿内4-5圆形玻璃盖玻片。
- 点70微升聚-D-赖氨酸到每个12毫米盖玻片。注:对于实时成像,玻璃底3.5厘米组织培养皿可以使用(现货200微升聚-D-赖氨酸上的嵌入式14毫米玻璃盖玻片)。
- 离开烹制的菜肴在组织培养罩的O / N。为了尽量减少聚-D-赖氨酸蒸发,并保持表面消毒的组织文化引擎盖,关闭窗扇和关闭日ê鼓风机的O / N。注:O / N孵化期间不使用紫外线灯。
- 第二天早上,洗碗3倍用2毫升H 2 O
- 删除最后一个H 2 O的洗涤后,加入2毫升媒体到每个3.5厘米菜,菜品留在孵化器,直到准备板的神经元在步骤1.4。
- 海马神经元从胚胎18-19天(E18-19)大鼠(从22戈斯林修改)编制。
- 转染新鲜分离的神经元在培养的一天1-4微克maxiprepped结构的DNA。
注意:通常为3的DNA微克转染到1-2万神经元,用50%的生存力和60%的转染效率( 例如,开始与2000000的神经元:((2×10 6个神经元×0.5)0.6)提供了约100万神经元;。故障排除潜在的问题,当其中600,000转染1不同量的结构的DNA可转过度表达,其次是结构定位和功能的相应特性。 - 镀上以每3.5厘米菜约200,000神经元的最终密度的聚-D-赖氨酸包被的盖玻片的转染的神经元。注:为玻璃底培养皿,板40,000-50,000神经元上14毫米的玻璃区域。
- 更换培养基制备神经元培养后4-24小时,然后让神经元发展的孵化器,直到在体外 (DIV)或所需的阶段14-17天。
2。内吞作用分析
注意:注意对α-银环蛇毒素和废物筒箭毒碱和处理:
- 处理所有肽神经毒素的建议的生物安全2级(BL-2)研究方案的指导方针。所有适当的个人防护装备必须佩戴。冻干粉剂毒素应根据制造商的说明进行配制。毒素废物的寿LD在遵守监管机构的环境,健康与安全准则处置。
- 以去除可能在储存期间形成的潜在的肽聚集体,α-银环蛇毒素的等分试样应简要使用前离心,并将上清液应该用于实验。
- α-银环蛇毒素(BGT)股票是在-20℃下再悬浮至1毫克/毫升的浓度在无菌H 2 O和存储于10μl等分试样荧光再加BGT股票是用在3微克/毫升。筒箭毒碱的用量为150μM的最终浓度。
- 设置台式加热块到16℃,在寒冷的房间,薄铝或不锈钢板之上。或者,如果有的话,一个台式冷却/加热设备可用于每个步骤需要16℃。
- 含有以mM凉爽外的Hepes缓冲盐溶液(HBS:135氯化钠,氯化钾4.7,10 HEPES,11葡萄糖,1.2的MgCl 2,和2.5氯化钙 ,pH值7.4),以16℃的水浴中。
- 传递神经元菜铝板在16℃,冷却5分钟。
- 移除媒体( 保留条件培养基和储备孵化器的步骤2.8,测定细胞内吞作用的时间点 )和替换用1毫升16°C HBS +筒箭毒碱(150微米)2分钟。
- 删除HBS +筒箭毒碱,以标签的废弃物容器,并更换1毫升16°C HBS +筒箭毒碱(150微米),+α-银环蛇毒素的Alexa 594 [3微克/毫升],孵育在16°C下15分钟。
- 删除HBS +筒箭毒碱+α-银环蛇毒素的Alexa 594,以标签的废弃物容器和洗碗3倍用2毫升16°C哈佛商学院(洗涤液可以通过在抽吸含有50ml 50%的漂白粉的保温瓶收集)。
- 对于实时成像时间序列实验用玻璃下面受体的内吞作用见底3.5厘米培养皿中,执行步骤2.1-2.6,然后转移到菜加热阶段(珀耳帖元件)上的显微镜,并开始成像共聚焦或全内反射荧光显微镜的设置。
- 转让T = 0的时间点盖玻片到RT 4%多聚甲醛/ 4%蔗糖20分钟的菜,与其他盖玻片继续步骤2.9。
- 对于其他的时间点,与哈佛商学院的更换平衡调节37℃介质(保留在步骤2.4),并在37°C 注回到孵化器内吞作用:建议对T = 15额外的时间点,30,和60。
- 在时间点需要,采取菜肴从培养箱中,用2毫升RT的DPBS洗涤两次快速(DPBS无钙,镁),然后在4%低聚甲醛/ 4%蔗糖20分钟固定。
- 20分钟后固定,除去4%多聚甲醛/ 4%蔗糖浪费容器,用2ml RT DPBS洗两次菜。
- 孵育盖玻片在RT中免疫块溶液10分钟(块溶液= 5%马血清,0.5%BSA的DPBS),含0.2%的Triton X-100对渗透率IZE的神经元,使细胞内的受体池和/或其他感兴趣的蛋白标记的抗GFP免疫染色。
- 删除块+ 0.2%的Triton X-100和孵化的免疫块解决方案无需盖玻片的Triton X-100为20-30分钟。
- 在4℃下进行块盖玻片一抗孵育在室温或O / N数小时注:与盖玻片初选在4℃的CO / N孵化常规生产改善免疫荧光结果。
- 洗盖玻片3X用DPBS(5分钟,每次洗涤步骤)。
- 孵育盖玻片,在1小时在室温块溶液的第二抗体。
- 洗盖玻片3X用DPBS(5分钟,每次洗涤步骤)。
- 摩盖玻片,单独搬运每个盖玻片:从盖玻片与实验室组织的去除背部多余的液体,然后倒置盖玻片到4微升玻片上安装介质。
- 允许片干燥在室温覆盖30分钟,然后ST在4℃的矿石,直到准备进行显微镜检查。
- 图像采集和实验,共聚焦显微镜(盲目的实验条件)进行分析。 60X油NA以下激光器1.49浸泡的目的:氩气488纳米,561二极管,640二极管。
- 使用相同的图像获取的设置,取得与该神经元的细胞体和在焦点几个树枝状突起单个Z截面图像。
- 沿20μm的每神经元3-4近端树突量化α-银环蛇毒素的Alexa荧光信号和GFP免疫染色,使用相同的阈值对所有的内吞作用的数据进行分析。
- 对于每个时间点分析从10-12神经元数据时,重复该实验与几个独立的神经元培养物。
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Representative Results
一个信息标记构建体的表征,包括重要的控制,如确定所表达的蛋白质正确装配(特别是与受体的多个亚基组成),贩卖到细胞表面,并适当地局部化。抑制性突触是由γ-氨基丁酸的共定位该具有抑制支架蛋白gephyrin并结合在突触前的抑制端子,确定囊泡抑制性氨基酸转运加载GABA和甘氨酸进入突触小泡(VIAAT / VGAT)A受体表面的集群。 如图2顷 α2pHGFP+ BBS表达神经元与表面GABAAR标记BGT,随后通过免疫染色为总人口的受体与抗GFP抗体和无论是突触后抑制支架蛋白gephyrin( 图2A)或VIAAT( 图2B)。
图3示出α的细胞内吞作用2含GABAAR在海马神经元在15格。单个树枝状突起的BGT荧光测量如在面板( 图3A)所示的归一构建体的表达通过GFP抗体染色的水平。的时间点上最终的比较是通过归一化到T = 0的测量作出, 如图3B所示 。受体在60分钟内( 图3B),从随时间的荧光信号变化的内在化定量(平均值±标准差:T0 = 100±7.2,T15 = 74.7±12.9,T30 = 44.7±5.6,和T60 = 19.1±3.4分钟T1 / 2 = 26±4.8分):)是最好的单指数(37℃描述。
另一种方法, 如图4所示,是通过实时成像的时间推移共聚焦显微镜跟随受体的胞吞作用在单个神经元。表面pHGFP的点状和重叠的荧光标记GABAAR和BGT升 abeled受体可见于实验(T0)的开始。随着时间进程,BGT标记GABA受体信号减小,如受体内吞,而pHGFP信号仍然很高,由于新的接收器插入。在phGFP信号的最小下降是由于细胞表面受体的分布变化和漂白。
图1。一个BBS和pHGFP的框图标签GABAAR亚基和胞吞作用测定。内吞作用是通过首先施加一个荧光标记的银环蛇毒素对神经元或细胞,随后简要介绍洗涤去除未结合的毒素测定,然后荧光损失被监视为受体是内化。
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BBS和pHGFP的图2。共焦成像标签GABAAR示出适当的定位与抑制性突触组件。表面GABAAR在α2pHGFP+ BBS表达神经元标记的α-银环蛇毒素的Alexa 594(红),其次是免疫染色,枝晶的放大示于右各神经元。合并后面板(α-银环蛇毒素Alexa的594红色,绿色荧光蛋白在绿色,gephyrin或VIAAT蓝色)。表面BGT标记GABAAR显示与共存一)抑制性突触后支架蛋白gephyrin和B)并置到突触前标记VIAAT。 (比例尺为10微米)。
图3。GABAAR的内吞作用在15 DIV海马神经元共聚焦成像。 A) ),B)图表示表面GABAAR的α-银环蛇毒素的Alexa随着时间的推移594荧光损失与内吞作用(归到T = 0)(每个时间点10-12的神经元,4个进程分析每个神经元;误差棒代表平均值±标准差)。
图4。GABAAR活细胞内吞作用的共聚焦成像技术在15 DIV的海马神经元。 A)B3pH的GFP +含有表面GABAAR在神经元信息是实时标记的α-银环蛇毒素的Alexa 594(红),随后简要除去未结合的α-银环蛇毒素的Alexa 594的洗涤。神经元,通过共聚焦显微镜在37℃在HBS成像为20分钟,在1分钟的时间间隔(比例尺为10μm)。 BGT标记GABAARs分别定位到细胞表面在T0,所看到的共存与pHGFP信号在T0。随着时间进程,BGT标记GABA受体信号减小,如受体内吞,不断被插入表达受体的新pHGFP,所以pHGFP信号几乎保持不变。
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Discussion
此处所描述的信息为基础的固定和活的技术可以被用来跟踪受体或其它细胞质膜蛋白质运输中的细胞系,神经元和其它的原代细胞。此法已成功地用于研究膜的插入和移除的配体门控离子通道和G蛋白偶联受体,并评估变化贩卖由于受体激动剂和调节剂的存在下进行。主要方面包括标签的适当定位到细胞外的位置,并进行控制,以确保增加的BBS(作为标准的其他记者,如GFP)在功能上是沉默的。对于在细胞表达烟碱乙酰胆碱(胆碱)受体的使用,胆碱受体拮抗剂筒箭毒碱,必须使用整个协议所指示的。在不使用额外的GFP标记的情况下,总信息标签的蛋白质水平可通过染色法与另外的α-银环蛇毒素结合到另一个荧光团固定和permeabiliz后确定通报BULLETIN。时间点测量感兴趣的受体/蛋白的内吞作用速率选择需要评估人口贩卖的现有知识的受体/蛋白,结合初次使用更多的时间点。这种技术也可以容易地采用常规的免疫染色。我们还描述了通过现场共聚焦成像实验进行跟踪受体的内吞作用的另一种方法。设备的可用性,现场实验,等实验的限制时间的要求将指导选择方法,无论是可行的和发布的技术。的BBS技术未来的应用包括活的或固定的成像结合内涵体和溶酶体标记遵循受体的命运, 即靶向循环内涵体和还船通过溶酶体质膜或退化。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
支持从匹兹堡大学医学院的药理学及化学生物学系提供启动基金。确认雅各布实验室成员谁促成了视频提交:尼古拉斯·格拉夫。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
(+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
Mounting medium | DAKO | cS703 | |
DPBS no calcium, magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
Gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1,000 |
anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2,000 |
Glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes | |
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |
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