Гистохимический Окрашивание<em> Арабидопсис</em> Вторичный клеточной стенки Элементы
Summary
Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Abstract
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
Introduction
Стена растительная клетка имеет множество информации в ее различных компонентов: лигнин, целлюлоза, гемицеллюлозы (ксилан, glucuronoxylan, ксилоглюкан, арабиноксилан, смешанная связь глюкан, или Glucomannan) и пектин. Гистологические методы обеспечивают важные визуальные подсказки в изучении различий внутри вторичных клеточных стенок в организационных и клеточном уровнях. Различные гистологические методы были разработаны и могут быть найдены в литературе, но эти методы могут быть сложным и трудоемким для начинающих, потому что очень подробные протоколы с простыми визуальными инструкциями редко, если когда-либо доступны. Целью данного исследования является предоставление рекомендациям по ее гистологических методов окрашивания для получения высококачественных изображений.
Секционирование шток ткани является первым шагом в визуализации клеточных стенок и клеточных форм. Хотя ручной огранки разделы недороги и займет меньше времени, чтобы подготовиться, использование Vibratome предлагает согласованность идает высокое качество изображения. Использование Vibratome позволяет производить лучшее качество данных путем генерации даже участки с той же толщины, что позволяет получать резкие снимки и значительно снижает риск получения неточных различия между образцами, которые будут просто вызванных плохой подготовки образца. Использование смолы исправить свежие образцы может быть проблемой для начинающих и до сих пор может занять много времени даже для специалистов, когда анализ нужно сделать быстро. Кроме того, становится невозможным измерить любой биологической активностью с образцом, когда он был встроен в смоле. Один простой метод, который использует агарозы и самодельный пресс-формы является полезным для встраивания стволовых ткани, а также может быть использован в других приложениях, требующих рассечение мягких тканей. По сравнению с вложением образцов в смоле, этот метод имеет то преимущество, что в ткани живых и снижения образец манипуляции. Секционирование ткани через Vibratome очень аккуратный и не генерирует однороднаяOUS разделы, которые, в зависимости от цели исследования, то можно использовать с несколькими различными методами окрашивания.
Простейшие методы для наглядного лигнин и другие ароматические соединения используют ультрафиолетовое (УФ) света. Возбуждение молекул ароматических основе УФ-светом старая техника, но он по-прежнему один из самых быстрых подходов для визуализации лигнина. Тем не менее, УФ визуализация на самом деле не является идеальным для обнаружения лигнина, потому что ультрафиолетовый свет будет возбуждать другие ароматические. Лигнин состоит в основном из трех блоков, в monolignols (hydroxycinnamyl спирты: кониферилового спирта, синапилового спирта и п-каумарильного спирт) 1-3. Флороглюцин пятно может дать ключ к степени cinnamaldehydes присутствующих в древесине, клетчатки, и трахеи тканей 4. Флороглюцин является хорошим показателем общих cinnamaldehydes и может различать cinnamaldehydes и других ароматических соединений. Мономеры синапилового спиртов могут быть обнаруженыи дифференцированы с помощью Мол пятна. Толуидин синий вывода полихроматичным краситель и, следовательно, имеет возможность окрасить различные элементы клеточной стенки в разные цвета 5,6. Основное применение толуидиновым синим O является выявление пектин и лигнин 5,6. Преимущество использования толуидиновым синим O является то, что многие элементы клеточной стенки могут быть визуализированы в одну стадию. Оба Calcofluor белый и конго красный легко работать, и может быть использован для визуализации целлюлозу. Calcofluor белые пятна целлюлозы, мозолистый, и другие не замещенных или слабо замещенных β-глюкан 6-9, в то время как конго красный пятна непосредственно к β-(1 → 4)-глюканы и особенно с целлюлозой 10,11. Целью данного исследования является предоставление простым рекомендациям для использования вышеупомянутых методов окрашивания для получения высококачественных изображений с А. THALIANA стеблей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разделы стволовые А. THALIANA широко используются для изучения организации клеток на вторичном клеточной стенки и качественно изучить различия между дикого типа и трансгенных растений. Обычно используемые методы секционирования образцы являются прямыми рука резки; или когда образц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Сабин Рассела за помощью редактирования. Эта работа была частью DOE Совместной BioEnergy института (http://www.jbei.org) при поддержке Департамента энергетики США, Управление по науке, Управления биологических и экологических исследований, с помощью контракта DE-AC02-05CH11231 между Лоуренса Беркли Национальная лаборатория и Министерство энергетики США.
Materials
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
| Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
- Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
- Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. . The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner’s guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
