प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और allosteric Ligand प्रभाव के काइनेटिक्स मापने के लिए जैव परत इंटरफेरोमेट्री
Summary
यहाँ प्रोटोकॉल जैव परत इंटरफेरोमेट्री साथ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की गतिज assays का वर्णन है. सेलुलर ऊर्जा चयापचय में शामिल है जो एफ प्रकार एटीपी synthase, बैक्टीरिया में अपनी ε सबयूनिट से हिचकते जा सकता है. हम ε की निरोधात्मक सी टर्मिनल डोमेन के साथ उत्प्रेरक परिसर के संबंधों का अध्ययन करने के लिए जैव परत इंटरफेरोमेट्री ढाल लिया है.
Abstract
हम Escherichia कोलाई एटीपी synthase उत्प्रेरक जटिल साथ सबयूनिट ε की निरोधात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए जैव परत इंटरफेरोमेट्री के उपयोग का वर्णन. बैक्टीरियल एफ प्रकार एटीपी synthase दवा प्रतिरोधी तपेदिक से निपटने के लिए एक नया, एफडीए को मंजूरी दी एंटीबायोटिक का लक्ष्य है. सबयूनिट ε के सी टर्मिनल डोमेन से एटीपी synthase की समझ बैक्टीरिया विशेष ऑटो निषेध जीवाणुरोधी दवाओं की खोज के लिए एंजाइम लक्ष्य के लिए एक नया अर्थ दे सकती है. Ε के सी टर्मिनल डोमेन सक्रिय और निष्क्रिय राज्यों, और उत्प्रेरक साइट ligands के बीच एंजाइम संक्रमण प्रमुख है ε की रचना की जो प्रभावित कर सकते हैं जब एक नाटकीय गठनात्मक बदलाव आए. परोक्ष रूप से ε के बंधन / उत्प्रेरक जटिल साथ हदबंदी, और विदेश मंत्रालय की परख उपायों कैनेटीक्सउपायों जाहिरा तौर पर nondissociable निरोधात्मक रचना करने के लिए और से एंजाइम बाध्य ε की पारी. जैव परत इंटरफेरोमेट्री संकेत समाधान संरचना करने के लिए पीढ़ी संवेदनशील नहीं है, तो यह भी ε के गठनात्मक परिवर्तन पर उत्प्रेरक साइट ligands की allosteric प्रभाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) की तरह लेबल से मुक्त तरीकों ऑप्टिकल 1 बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया है. अधिकांश लेबल से मुक्त तरीकों एक संवेदक सतह पर एक बायोमोलिक्यूल स्थिर करना और इसे immobilized बायोमोलिक्यूल 1 के साथ सहयोगियों के रूप में समाधान से एक बाध्यकारी साथी का पता लगाने के लिए एक ऑप्टिकल संकेत का उपयोग करें. एसपीआर एक बेहद संवेदनशील विधि है, यह कारण संवेदक 2 पर बह समाधान का अपवर्तनांक में परिवर्तन करने के लिए हस्तक्षेप की संभावना है. एसपीआर, जैव परत इंटरफेरोमेट्री (BLI) के रूप में संवेदनशील नहीं कम नमूना रचना 1,3 में परिवर्तन से प्रभावित होता है. BLI नोक पर एक मालिकाना biocompatible कोटिंग है कि फाइबर ऑप्टिक biosensors का उपयोग करता है. (octet-RED96) का यहां इस्तेमाल किया प्रणाली आठ स्पेक्ट्रो होता है. सफेद रोशनी एक रोबोट बांह पर कदम है कि जांच की एक पंक्ति को पहुंचाया जाता है. फाइबर ऑप्टिक सेंसर की गिरफ्तारीई जांच से उठाया और नमूने युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली में ले जाया गया. लक्ष्य अणुओं में से एक biosensor सतह पर स्थिर है. फिर सेंसर समाधान में बाध्यकारी साथी युक्त कुओं में ले जाया जाता है. BLI immobilized अणु के साथ बंधन साथी के सहयोग से नज़र रखता है, और फिर बाध्यकारी साथी के बिना समाधान के लिए सेंसर जाने के बाद हदबंदी नजर रखता है. Biosensor सतह अणुओं के बंधन एक आंतरिक सतह से और सेंसर और समाधान के बीच बाहरी इंटरफ़ेस से वापस स्पेक्ट्रो को प्रतिबिंबित कि प्रकाश तरंगों के बीच ऑप्टिकल हस्तक्षेप में परिवर्तन होता है. हस्तक्षेप में ये परिवर्तन और मात्रा निर्धारित चित्रा 1 के एनीमेशन में संक्षेप के रूप में, बंधन और पृथक्करण की गतिज दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम उत्प्रेरक बैक्टीरियल एटीपी synthase की जटिल और एंजाइम ऑटो बाधित कर सकते हैं जो अपनी ε सबयूनिट, के बीच बातचीत को मापने के लिए BLI आवेदन किया है. एटीपी एसवाईnthase संश्लेषण और एटीपी 4 की hydrolysis catalyzes कि एक झिल्ली एम्बेडेड रोटरी nanomotor है. उत्प्रेरक परिसर (एफ 1) एक ATPase के रूप में काम करता है कि एक घुलनशील रूप में अलग किया जा सकता है. सबयूनिट ε दो डोमेन है: एन टर्मिनल डोमेन (NTD) उचित विधानसभा और एंजाइम की कार्यात्मक युग्मन के लिए आवश्यक है, लेकिन उत्प्रेरक सब यूनिटों के साथ सीधे बातचीत नहीं करता; सी टर्मिनल डोमेन (CTD) के साथ बातचीत से एंजाइम को बाधित कर सकते हैं कई उत्प्रेरक सब यूनिटों 5,6. इस ε की मध्यस्थता विनियमन बैक्टीरियल एटीपी synthases के लिए विशिष्ट है और mitochondrial सजात में नहीं मनाया जाता है. दवा प्रतिरोधी तपेदिक 7 के इलाज के लिए bedaquiline की हाल ही में एफडीए अनुमोदन के रूप में दिखाया एटीपी synthase, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एक लक्ष्य के रूप में उभरा है. इस प्रकार, दवाओं की खोज के लिए ε की निरोधात्मक भूमिका को लक्षित mitochondrial एटीपी synthase को बाधित नहीं है कि antibacterials उपज सकती है. पृथक उत्प्रेरक परिसर (एफ 1), ε के साथएक अयुक्त सबयूनिट हो जाता है. हालांकि, एफ 1 के लिए बाध्य ε साथ, εCTD आंशिक रूप से एंजाइम की केंद्रीय गुहा में डालने और सीधे 6,8 अलग कर देना करने की संभावना नहीं है कि एक निरोधात्मक राज्य के गठन, एक नाटकीय गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं. हम उत्प्रेरक साइट ε की रचना पर ligands की allosteric प्रभाव की जांच करने के लिए परोक्ष रूप से एफ 1 / ε बाध्यकारी और पृथक्करण की कैनेटीक्स को मापने, और करने के लिए BLI का उपयोग करें.
हमारी प्रणाली में, ε (एसपीआर) की तरह BLI संकेत के बाद सेंसर की सतह पर स्थिरीकरण के लिए चुना गया था सतह पर बाध्यकारी अणु की जन के प्रति संवेदनशील है. ε सबयूनिट मुख्य एफ 1 जटिल (~ 347 केडीए) के लिए छोटे (~ 15 केडीए) रिश्तेदार है. इस प्रकार, एक बड़ा BLI संकेत immobilized ε एफ 1 के बंधन से परिणाम होगा. बहुत धीमी गति से किया जा सकता है एफ 1 हदबंदी की निगरानी करने के लिए, ε दृढ़ता से स्थिर हो जाना चाहिए. इस प्रकार हम biotinylate करने के लिए चुना; और streptavidin लेपित biosensors पर यह स्थिर करना. प्रोटीन सतह lysines 9 (i) यादृच्छिक संशोधन, एक बायोटिन maleimide अभिकर्मक 10 या (iii) आनुवंशिक रूप से enzymatically दौरान biotinylated है कि एक विशिष्ट बायोटिन स्वीकर्ता पेप्टाइड को जोड़ने के साथ एक अद्वितीय देशी या इंजीनियर सिस्टीन (ii) प्रतिक्रिया से biotinylated किया जा सकता है टैग प्रोटीन 11 के vivo अभिव्यक्ति में. हमारी प्रणाली में, ε विधि (तीन) 8 का उपयोग biotinylated है. बायोटिन टैग ε streptavidin सेंसर पर स्थिर हो जाने के बाद, BLI बाध्यकारी और सबयूनिट ε (एफ 1 (ε)) के समाप्त हो गया है कि एफ 1 की हदबंदी उपाय कर सकते हैं. यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, प्रारंभिक assays के सेंसर पर स्थिर biotinylated प्रोटीन की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था. इस प्रोटीन की आणविक वजन और अपनी बाध्यकारी साथी पर निर्भर करता है, भिन्न हो सकते हैं, लेकिन लक्ष्य immobilized प्रोटीन टी की एक न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए हैटोपी प्रदान करता है (मैं) स्वीकार्य संकेत करने वाली शोर एक (कश्मीर डी नीचे) बाध्यकारी साथी की कम एकाग्रता और बाध्यकारी साथी के पास saturating एकाग्रता के साथ कैनेटीक्स बंधन (ii) न्यूनतम विरूपण के साथ कैनेटीक्स बाइंडिंग के लिए. इसके अलावा, biotinylation के stoichiometry एक सुसंगत BLI संकेत streptavidin लेपित पर स्थिरीकरण के दौरान प्राप्त किया जा सकता है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए अलग अलग है (लेकिन> 1 मोल बायोटिन / मोल प्रोटीन से बचने), तो कुछ प्रारंभिक परख biotinylated प्रोटीन के प्रत्येक नए बहुत कुछ के लिए आवश्यक हो सकता है हो सकता है सेंसर.
Protocol
Representative Results
Discussion
BLI के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों biomolecular बातचीत के लिए assays में महत्वपूर्ण throughput और लचीलेपन की अनुमति. विभिन्न समाधान नमूने एक काला microtiter प्लेट के कुओं में तिरस्कृत कर रहे हैं, और समानांतर BLI सेंसर का एक सेट प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चित्रा 1 में इस्तेमाल किया ग्राफिक्स प्रदान करने के लिए FortéBio धन्यवाद. इस काम TMD के लिए NIH अनुदान GM083088 द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
References
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
