Den ekstracellulære matrise gjennomgår betydelig ombygging under sårtilheling, betennelser og tumorigenesis. Vi presenterer en roman intra immunfluorescens mikros tilnærming til å visualisere dynamikken i fibrillær og nettinglignende matrikskomponenter med høy romlig og tidsmessig oppløsning ved hjelp epifluorescence eller to-foton mikroskopi.
Foruten å være en fysisk stillas for å opprettholde vev morfologi, er den ekstracellulære matrix (ECM) aktivt involvert i regulering av celler og vev funksjon under utvikling og orgel homeostase. Det gjør det ved å handle via biokjemiske, biomekaniske, og biofysiske signalveier, for eksempel gjennom utgivelsen av bioaktive ECM protein fragmenter, regulere vev spenning, og gir trasé for celle migrasjon. Den ekstracellulære matriks av svulsten mikromiljøet gjennomgår vesentlig ombygging, karakterisert ved nedbrytningen, avsetning og organisering av fibrillar og ikke-fibrillar matriksproteiner. Stromal stivne av svulsten mikromiljøet kan fremme tumorvekst og invasjon, og føre til ombygging av blod-og lymfekar. Sanntids avbildning av matriksproteiner, men til dette punkt er begrenset til fibrillar kollagen som kan oppdages av andre harmonisk generering ved hjelp av multifotonmikroskopi, og etterlater det meste av matrikskomponenter largely usynlig. Her beskriver vi prosedyrer for tumor-inokulering i den tynne øret dorsal hud, immunolabeling av ekstracellulære matriksproteiner og intravital avbildning av det eksponerte vev i levende mus ved hjelp epifluorescence og to-fotonmikroskopi. Vår intravital avbildningsmetoden gir mulighet for direkte påvisning av både fibrillar og ikke-fibrillar matriksproteiner i sammenheng med en økende dermal tumor. Vi viser eksempler på fartøyet remodellering forårsaket av lokal matriks sammentrekningen. Vi har også funnet at fibrillær grunnmasse av den detekterte med den andre harmoniske generering tumor er romlig distinkt fra nylig avsatt matrikskomponenter som tenascin C. Vi viste også langvarig (12 timer) avbildning av T-celle-interaksjon med tumorceller og tumorceller migrasjon langs kollagen IV av basalmembran. Samlet utgjør dette en unik fremgangsmåte gjør det mulig for den samtidige påvisning av tumorceller, deres fysiske mikromiljøet og den endogene immunrespons vev over tid, noe som kan provide viktig innsikt i mekanismene bak tumorprogresjon og endelige suksess eller resistens mot behandlingen.
Intra avbildning av inflammatorisk, metastatisk og matrise remodeling prosesser har vært et viktig område for forskning og har motivert etableringen av en rekke transgene reporter musemodeller som uttrykker fluorescerende proteiner 1,2. På grunn av ut-av-fokus fluorescerende signaler som reduserer bildekvaliteten og grenser lyser penetrasjon gjennom vevet, er bildebehandling tykk vev bare mulig med confocal eller multi-foton scanning mikros tre. Ved hjelp raskere, er mindre kostbart og komplisert epifluorescence mikros bare mulig med nesten to-dimensjonale vev som kylling chorio-allantoic membran fire eller mus øret dermis fem. De fleste bildedanningssystemer dra nytte av transgene mus som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner i en celletype-spesifikk måte. Selv om disse proteiner har svakt fototoksisitet, de induserer immunrespons 6.. Videre er det vanskelig å skifte mellom spesifikke celle subtyper eller merkeir basal eller aktiverte tilstander som slik endring krever utarbeidelse av en ny genetisk modell. I tillegg, som fluorescerende protein ekspresjon er vanligvis begrenset til intracellulær kammer, er det vanligvis ikke mulig å avbilde ekstracellulære strukturer som basalmembran proteiner eller vev chemokine avleiringer 7. I stedet, indirekte merking med antistoffer mot ekstracellulære antigener tilbyr fleksibilitet for nesten hvilken som helst celle-type eller matrise spesifikk komponent 8,9. Imidlertid er den største ulempen med denne merking tilnærming forbundet med immunotoxicity mediert av antigen-antistoff-immunkompleksene som kan utløse komplementsystemet avhengige celletoksisitet og fagocytose av celler og ekstracellulære strukturer 10.
Den ekstracellulære matriks av svulsten mikromiljøet, men også for normale vev ved inflammasjon eller sårheling, gjennomgår en betydelig ombygging. Stromal stivne av svulsten mikromiljøet kan promote tumorvekst og invasjon på grunn av stress-indusert signalmekanismer og årsaken ombygging av blod og lymfekar 11. Imidlertid er direkte avbildning av matriksproteiner begrenset til fibrillar kollagen som kan oppdages av andre harmonisk generering ved hjelp av multi-foton mikroskopi. Nylig har vi publisert en roman intraavbildningsmetode som minimerer risikoen for foto-og immun-toksisk skade fotografert celler og vev strukturer fem. I sammenligning med etablerte avbildningsteknikker hvor enkelt runde med kontinuerlig intravital visualisering er i et område på 30 minutter til 2 timer 12 til 17, vår intravital immunfluorescens (IF) teknikk tillatt 12 timer (langtids 8) avbildning. Det er viktig å merke seg at avbildnings tiden er begrenset til 12 timer på grunn av begrensningene beskrevet i vår dyr protokoll, men det er ingen tekniske mot indikasjoner på at den ikke kan forlenges hvis kritiske helse parametere av dyret, slik som blodtrykk og hjertesats blir kontrollert åtte. I tillegg, ved å bruke en automatisert fluorescens stereomikroskop var vi i stand til å samle inn bilder fra flere felt i løpet av et enkelt forsøk og observert sjeldne immunologiske og ombygging prosesser som skjedde i fysiologisk sammenheng med huden støttet av funksjonelle blod-og lymfekar. Fordi stereomicroscopic objektivet har en relativt stor, 2 cm, arbeidsavstand, og i motsetning til to-foton mikroskopiske optikk ikke krever fordampning av nedsenking i vann, ble langvarig avbildning utføres bare under fluorescens stereomikroskop. Intravital IF tillates immun merking og påvisning av hvilken som helst ekstracellulære matriks-komponenten i normal hud. Konstruksjonen av denne teknikken er basert på den innovative konseptet med å bruke farging for levende celler og vev matriseelementer for kirurgisk eksponerte musehuden uten å forårsake skadelige virkninger immunotoksisk 5. Den kirurgiske prosedyren i seg selv er trygt å dermisvaskulaturen den er avhengig bare av separasjon av to hudlagene i øret som er uavhengig innerverte, autonomt matet av blod og dreneres ved hjelp av separate lymfatiske opplag. Vår eksperimentelle oppsettet tillater avbildning av en rekke viktige patofysiologiske arrangementer over minst 12 timer, inkludert leukocytter trafficking mellom blod og lymfekar og sårheling prosesser. I den opprinnelige publikasjonen, sammenlignet vi vår teknikk for å state-of-the-art standarder i ulike felt av intra bildebehandling. Derfor observerte vi blodåre bloduttredelse og lymfatiske intravasation hendelser av ulike typer leukocytter, inkludert den unike visualisering av immunceller inn innsamling i stedet for forventet innledende lymfekar 15. Også, sammenfallende med observasjoner gjort av andre grupper 9,18, fant vi at in vivo CCL21 er i stand til å danne sterke, usammenhengende innskudd på å samle inn, men bare sjelden på innledende lymfekar.
<p class = "jove_content"> Her beskriver vi en modifisert intra IF teknikk som kan kombineres med to-foton mikroskopi for å oppdage nettverk av fibrillar colla bruker andre harmoniske generasjon (SHG). Vi viser at denne metoden også kan anvendes for avbildning kreftcelle invasjon i forbindelse med det dynamiske tumor mikromiljøet, som inkluderer matriks-molekyler som tenascin C, som er lite utforsket av nåværende bildeteknikker 19. Vi fant at fibrillar matrise av tumor, detekteres med det andre harmonisk generering, inntar ulike steder på tumormikromiljøet enn den nylig avsatt matriks sammensatt av tenascin C. Videre har vi beskrive eksempler på fartøyet remodellering forårsaket av lokal matriks sammentrekningen, lang sikt (12 timer) avbildning av T-celle-interaksjoner med tumorceller og tumorcellemigrering langs kollagen IV i basalmembran. Slike hendelser kan avbildes samtidig opptak lokale fysiologiske parametre som blodårer permeability og lymfedrenasje.Betydning
Her presenterer vi en ny intramikros tilnærming som gir høy oppløsning og dynamisk visualisering av ulike vev mikromiljøet komponenter, inkludert fibrillær samt mesh-aktig matriksproteiner. Denne fremgangsmåten har flere fordeler fremfor nåværende intrabildeteknikker: (i) Intravital fluorescens avbildning har vært brukt i mikrosirkulasjon studier, f.eks, for å spore oppløst stoff lekkasje fra blod eller i lymfekar, men har ikke blitt kombinert med farging. (Ii) Bruk av genmodifiserte reporter mus muliggjør bestemte celletyper å bli fotografert, men krever deres tilgjengelighet (eller betydelig innsats for å skape nye) og begrenser antallet samspill celletyper som kan studeres. (Iii) Ekstracellulær matriks kan avbildes in vivo ved hjelp av andre harmonisk generering, men denne teknikk kan kun detektere fibrøse kollagen, slik at et stort antall viktige ekstracellulære komponenterfor eksempel kjelleren membraner, fibronectins, tenascins, vekstfaktorer, kjemokiner og vev glycosaminoglycans utilgjengelig for dagens forskning. Vår metode overvinner disse begrensningene, og tillater standard bildeteknikker som skal innarbeides og videre kombinert med immunostainings for andre celletyper, vev strukturer, innskudd av heparin-sulfat bindende vekstfaktorer (for eksempel VEGF 26) og kjemokiner (CCL21 5,18 og fig. 2D ), eller ekstracellulære matriksproteiner og samtidig sporing av blod og / eller lymfatiske strømmer.
Begrensninger
Den epifluorescence avbildning av intra IF er begrenset til den tynne huden flaps, fratatt tykke hypodermis (fettvev). Mens vi fant at rygg øret dermis er optimal for relativt harmløs kirurgisk utredning av øret huden, epifluorescence med intra IF teknikken ikke er begrenset til øre dermis og kan potensielt brukes til f.ekseksponert hud av tærne eller baksiden hud hos den nyfødte mus. Rapid antistoffarging (15 minutter) i immunfluorescens IF er ikke avhengig av passiv diffusjon, men krever funksjonell lymfedrenasje og interstitiell væske flyt, dermed ingen flekker kan observeres dersom lymfekar er occluded 27. I tråd med det, lymfekar flekken sterkere da lekk blod blodkar (skadet fartøy, arterioler) 5. Separasjonen av den dorsale og ventrale øre hudlapper er en mild kirurgisk inngrep, men det fører til skade på enkelte kapillarer og celledød i en rekke vev celler. Dette kan være et problem når man har behov for å undersøke helt intakt vev, for eksempel ser på milde virkning av legemidler på celleoverlevelse. Også anvendelsen av antioksidant som tjener til å beskytte huden mot fototoksisitet og fotobleking utelukker bruk av intravital immunfluorescens teknikk for å studere f.eks vevet oksidativt stress eller nitrogenoksid biology.
Endelig kan blinding av vev hørende makrofager med immunkomplekser aktivere disse celler og påvirker f.eks studiet av vevet immunrespons og dendrittiske celleaktivering.
Modifikasjoner og feilsøking
For å undersøke vevet oksidativt stress eller nitrogenoksid biologi, har askorbat for å bli erstattet med andre vev kompatible medier som ikke interfererer med den eksperimentelle utgang. Likeledes bør blokkerer Fc reseptorer på dermal immunceller unngås hvis målet med studien er den funksjon og aktivering av vev immunrespons og dendrittiske celle aktivering og migrasjon. Dette kan gjøres ved bruk av sekundære antistoff med Fc-fragmentet spaltes (2 antistoff-fragmenter F (ab)) eller ved bruk av biotinylert antistoff og fluorescerende streptavidin som påvisningsreagenser.
Fremtidige søknader
Vi presenterer en ny og unik intravital IF teknikk til bilde non-fibrillar komponenter i ekstracellulær matrix i transplant hudsvulster i kombinasjon med SHG-oppdaget fibrillær og modnet collagens hjelp av to-foton mikroskopi. En av fordelene ved å bruke multi-foton (eller konfokal) mikroskopi enn epifluorescence avbildning er z-stabling mulighet og som følge romlig ko-lokalisering av hendelser som skjer i løpet av ekstracellulær matriks, for eksempel tumor intravasation inn i lymfesystemet eller blodkaret, som i tilfellet standard epifluorescence mikroskopi kan bare utledes fra morfologiske endringer av invaderende celle. Denne teknikken har langt bredere potensial. For eksempel har vi brukt intra IF å undersøke mekanismene for lymfatisk okklusjon av lymfatisk-spesifikke fotodynamisk terapi 27. Andre potensielle anvendelser for denne metoden inkluderer, men er ikke begrenset til undersøkelse av huden immunitet under betennelse, mekanismen for transplantasjon avvisning eller metoder for blod og lymfe atic fartøy vekst under tumorigenesis.
Kritiske trinn i prosedyren
Det viktigste som har kritiske betydning for å opprettholde en fysiologisk vev miljøet er en kirurgisk separasjon av den ventrale hud og brusk fra rygghuden. Kutting eller okkludere det store arterie eller vene vil føre til overdreven blødning og lokal hypoksi i vev, noe som vil påvirke cellulær respons til behandlinger og cellebevegelse 8.. Immobilisering av øret med kirurgisk lim bør gjøres med forsiktighet da søle limet på eksponere vevet vil føre til en permanent skade på vev ved okklusjon av blodkar. Temperaturen på mus må kontrolleres og holdes ved 37 ° C. I tillegg må fuktet oksygen for å bli brukt for isofluran anestesi, slik at øynene og lunger bli skikkelig fuktet i løpet av eksperimentet. Dessuten må natriumaskorbat fremstilles friskt og dens pH-verdi kontrollert før bruk.
ntent "> I sammendraget, broer dette intra immunfluorescens sanntid, lokale målinger av fysiologiske funksjon med molekylær avbildning av komplekse cellulære hendelser i musen huden. Videre har denne metoden stort potensial som den enkelt kan brukes til f.eks studie post-utviklings mekanismer av blod og lymfe-angiogenese eller å visualisere de tidlige fasene av hudinfeksjon av ulike smittestoffer. Med sin fleksibilitet og høy gjennomstrømning potensial, kan dette intra teknikken bidra betydelig til flere felt av biologi.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for Jeremy CM Teo og S. Ryan Oliver for deres bidrag og Jolanta Kilarska om hjelp i bildebehandling. Vi takker BIOP kjernefasilitet på EPFL for støtten med to-foton mikroskopi
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra European Research Commission (DC-lymfe, 206653-2), European Framework Prosjekt 7 (AngioScaff), den sveitsiske National Science Foundation (31-135756), og det amerikanske National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). I tillegg midler fra Robert Wenner Award (sveitsisk Cancer League) tillot kjøp Leica stereo brukt i denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |