Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av nevralrøret, men migrere for å nå nødvendige mål. Facial branchiomotor (FBM) nevroner er en nyttig modell for å studere nevronale migrasjon. Denne protokollen beskriver wholemount ex vivo kultur av muse embryo hindbrains å undersøke mekanismene som regulerer FBM migrasjon.
Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av hjernen, men deretter migrere til nye destinasjoner for å nå nødvendige mål. Forklaring på de molekylære signaler som i fellesskap styrer neuronal migrasjon i embryonale hjernen er derfor viktig å forstå hvordan de komplekse nevrale nettverk danner som senere støtte postnatal liv. Facial branchiomotor (FBM) nerveceller i mus embryo hindbrain migrere fra rhombomere (r) 4 caudally å danne de sammenkoblede ansikts kjerner i R6-avledet regionen hindbrain. Her gir vi en detaljert protokoll for wholemount ex vivo kultur av muse embryo hindbrains egnet til å undersøke signalveier som regulerer FBM migrasjon. I denne metoden, er hindbrains av E11.5 mus embryoer dissekert og dyrket i en åpen bok forberedelse på cellekultur innsatser for 24 hr. I løpet av denne tiden, FBM nevroner migrere caudally mot R6 og kan bli utsatt for funksjons-blokkerende antistoffer og små molecules i kulturmediet eller heparin perler lastet med rekombinante proteiner for å undersøke roller for signalveier involvert i guiding neuronal migrasjon.
Embryonale nevroner er født i ventrikkel sonen av hjernen, men deretter migrere til nye destinasjoner for å nå nødvendige mål regioner som er plassert på en stor avstand. Korrekt plassering av nevronale celler organer på egnede steder langs dorso-ventral og anterior-posterior aksene i utviklingen av hjernen er avgjørende for riktig kabling, overlevelse og funksjon av disse nevronene etter den vandrende stadium 1-4. I likhet med de molekylære mekanismer som styrer axon veiledning 5-7, er kombinatoriske sett med attraktive og frastøtende signaler tenkt å veilede trekkende nevroner 1,8. Imidlertid, på grunn av interaksjoner av mange celletyper, vil signalene som kontrollerer nevronal migrasjon er mindre grundig studert enn de som er involvert i axon veiledning, som kan studeres celle autonomt. Den utvikler hindbrain av virveldyr har vært brukt i flere nyere studier for å forstå de molekylære og cellulære mekanismerav neuronal migrasjon, for eksempel i chick, mus og sebrafisk 1-4,9. Dette organet inneholder flere forskjellige typer nevroner, deriblant flere undergrupper av precerebellar og motoriske nevroner 5,7,10,11.
Hindbrain motorneuron er født i ventrikkel sone nær gulvplate, og de differensieres til bestemte undergrupper i henhold til deres rhombomere utstedt på 1,12. Ansikts branchiomotor (FBM) nevroner er generert i rhombomere (r) 4 i hindbrain og utvide sine axoner dorsally gjennom en R4 exit punkt i den andre branchial buen til innerverer ansiktsmusklene 2,9,13. FBM nevroner av sebrafisk og mus gir gode modeller for å studere de molekylære og cellulære mekanismer for neuronal migrasjon i en prosess som er lett visualiseres, fordi disse nevronene reproduserbart translocate deres somata i en spatiotemporally veldefinert prosess. Hos mus, FBM nevroner først migrere cauDally gjennom r5 og deretter både caudally og ventrally å nå sin endelige posisjon på pial siden av hindbrain på territoriet til R6, hvor de danner de sammenkoblede kjerner av VIIth hjernenerven (VIIn) 10,11,14. I sebrafisk, FBM nevroner i utgangspunktet migrere ventralt og deretter endre retning på R4-R5 grensen til å fortsette å migrere mot pial overflaten i en laminin avhengig måte 4,12,15,16. Denne migrering forløper over en periode på flere dager i utvikling og kan deles inn i faser for tangential og radial migrasjon, slik at identifisering av molekyler som formidler disse to adskilte prosesser. I kontrast til FBM nevroner av embryonale chick hindbrain forbli i R4 3,13,17-19.
Under deres migrasjon, kan FBM nevroner bli identifisert, i likhet med andre typer eller motoriske nevroner, gjennom deres uttrykk for homoeodomain transkripsjonsfaktor holme 1 (ISL1) 14. Dermed engremount immunfluorescens flekker eller in situ hybridisering for denne markøren på ulike utviklingsstadier avslører tydelig vandrende strøm av FBM somata strekker seg fra R4 til R6 i sebrafisk eller mus 4,15,16. Videre har fluorescerende transgene journalister som ISL1-GFP blitt brukt som egnede verktøy for å visual migrere FBM nevroner i sebrafisk 3,17-19. I tillegg til deres egnethet for bildebehandling, har mange etterforskere undersøkt migrering av FBM nevroner i å utvikle sebrafisk, fordi deres frittlevende embryoer kan manipuleres lett med celle transplantasjon teknikker og farmakologiske stoffer som brukes direkte til akvariet vann. I kontrast, utvikler musen embryo vedlagt i livmoren, utelukker implantasjon av perler bærer veiledning pekepinner eller administrasjon av funksjons-blokkerende antistoffer som ikke krysser placenta. Videre kan farmakologiske forbindelser administreres til gravide moren har unønskede bivirkninger som indirekte kan svekke embryogenesis. Omgå denne begrensningen, har vi utviklet en ex vivo kultur metode for hele mus hindbrain som er kompatibel med FBM neuron migrasjon og overlevelse for 24 timer etter eksplantere 7,16. Denne metoden gir enkel farmakologisk manipulasjon, implantasjon av perler bærer veiledning pekepinner eller administrasjon av funksjons-blokkerende antistoffer og kan også tilpasses for å studere migrasjon av andre nevrale subtyper i hindbrain på ulike utviklingsstadier.
Denne protokollen beskriver wholemount kultur E11.5 mus hindbrains i en Transwell system for å studere migrasjon av FBM nevroner. Denne protokollen tillater mus hindbrain motorneurons å holdes i live og migrerer i en periode på 24 timer, slik at ex vivo manipulering. Denne metoden har mange eksperimentelle fordeler for etterforskerne som søker å identifisere de molekylære og cellulære mekanismer for neuronal migrasjon. Mens tradisjonelle migrasjons analyser eksplanterer små nevrale vev brikker i matrise på kultur retter og muliggjøre observasjon av enkelte nerveceller som de reagerer på eksogene stimuli, er en stor fordel med den Transwell analysen sin egnethet til å manipulere trekkende nevroner i verten orgelmiljøet og dermed en mer fysiologisk sammenheng. Viktigere, kan stoffene være lett brukes på ex vivo hindbrain eksplantater å teste deres virkning på neuronal migrasjon, omgå mulige bivirkninger forbundet med administeringe disse stoffene til en gravid mus. Til slutt, den ex vivo modellen gjør også testing av stoffer som ikke krysser placenta, slik som funksjons-blokkerende antistoffer. På grunn av disse fordeler, gir den ex vivo hindbrain kultur en alternativ og komplementær fremgangsmåte til ved hjelp av sebrafisk embryoer, som kan behandles med vannoppløselige små molekyler i akvarievannet, eller in utero elektroporering av embryonale hjernen, noe som krever bruk av spesialisert maskiner og er mer vanskelig å mestre enn den dyrkningsteknikk som er beskrevet her. En annen fordel med den protokoll som er beskrevet her er dens amenability å implantere perler fuktet i rekombinant protein eller andre reagenser, derfor tillater bruk av en standard embryologisk metode som er utviklet for å manipulere kyllingembryo til en musemodell for nevronal migrasjon. Spesielt kan den ex vivo kulturmodell anvendes på hindbrains av genetisk modifiserte mus defektetive i spesifikke molekyler involvert i neuronal migrasjon, for eksempel vekst eller veiledning faktor reseptorer, og kombinert med perle implantater for å teste om respons til ligander er tapt. I tillegg til farmakologisk manipulasjon, kan den ex vivo kultur protokoll også tilpasses electroporate ekspresjonsvektorer som kan manipulere ekspresjon av gener som er av interesse, og passende metoder for elektroporering har tidligere blitt beskrevet 22,23. Denne protokollen kan også tilpasses til å visualisere nevron migrasjon av time-lapse mikros i hindbrain eksplantater fra transgene mus som inneholder fluorescensmerkede FBM nevroner, f.eks Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Endelig kan denne protokoll også brukes til å studere andre typer av trekk nevroner i hindbrain, slik som de som danner den nedre oliven, selv om dette ville kreve bruken av hindbrains ved eldre embryonic stadier, og kan kreve kultur i opp til 48 timer, avhengig av nevronale levedyktighet <em> Ex vivo.
Kritiske trinn og feilsøking
For å lykkes med denne protokollen, er det avgjørende at embryoer samles tidlig på dagen E11.5, nærmere E11.25, når FBM nevron migrasjon har nettopp begynt. Imidlertid er det ikke alltid mulig å fange embryoer på dette utviklingstrinn på grunn av naturlig parring variasjon av mus, og følgelig kan det være en viss variasjon i den strekker seg over FBM flytting mellom forskjellige eksperimenter. Variasjon i FBM migrasjon kan også observeres dersom eksperimentet ikke er fullført innen tidsrammen tilordnet, omtrent 3 timer, som kan sees i figur 3E. Hindbrain vev fra E11.25 mus embryoer er delikat. Når dissekere og gjennom eksplantering prosedyren, er det viktig å ikke rive hindbrain vev i områdene fra r4-r6 hvor FBM neuroner er plassert. På grunn av den skjøre natur av dissection prosess, og fordi hastigheten som hindbrains er plassert i kultur påvirker utfallet, kan prosedyren ta et par praksis går å mestre, særlig før edle prøver eller reagenser brukes. Til slutt er det viktig at hindbrain vevet anbringes i en åpen bok-konfigurasjon på innsatsen kulturen, for folding av hindbrain vevet under kultur vil hindre normal FBM migrering (figur 3F).
The authors have nothing to disclose.
MT er støttet av et PhD student [ref. 092839/Z/10/Z] og CR av en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] fra Wellcome Trust.
Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
Cell culture plates, 12 well | Thermo Scientific | 150628 | |
Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
Recombinant human VEGF165 | R&D systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |