Tetrads के बारकोड Enabled अनुक्रमण (सर्वोत्तम), अलग खलल न डालें और tetrads रिक्ति के मैन्युअल प्रक्रिया को बदलता है. श्रेष्ठ, अगर प्लेटों पर छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा tetrads आइसोलेट्स ग्लास मनकों के साथ आंदोलन द्वारा बीजाणुओं को अलग करता है, और बेतरतीब ढंग से arrayed कालोनियों आणविक बारकोड का उपयोग कर एक ही मूल TETRAD से प्राप्त किए गए, जो निर्धारित करता है.
TETRAD विश्लेषण खमीर आनुवंशिकी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, लेकिन इस प्रक्रिया की श्रमसाध्य पुस्तिका प्रकृति बड़े पैमाने पर अपने आवेदन रुकावट है. बारकोड Tetrads का अनुक्रमण (सर्वोत्तम) 1, अलग खलल न डालें और tetrads रिक्ति के मैन्युअल प्रक्रिया को बदलता है Enabled. श्रेष्ठ सीधे ASCUS enzymatically पच जाता है और बीजाणुओं बाधित कर रहे हैं और बेतरतीब ढंग से गिलास मनका चढ़ाना द्वारा arrayed जहां अगर प्लेटों, पर tetrads की प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई कि परमिट एक sporulation विशेष GFP संलयन प्रोटीन की हैसियत से tetrads आइसोलेट्स. बीजाणुओं जीनोटाइपिंग के दौरान पढ़ा आणविक बारकोड का उपयोग कर, एक ही TETRAD से उत्पन्न यानी जानकारी के बारे में जो अगुणित कालोनियों तो, बहन बीजाणु रिश्तों सौंपा है. पुस्तिका विच्छेदन की टोंटी को दूर करके, tetrads के भी सैकड़ों या हजारों मिनट में अलग किया जा सकता है. यहाँ हम खमीर में सबसे अच्छा प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण पेशSaccharomyces cerevisiae, अगुणित meiotic संतान से व्युत्पन्न कालोनियों के अलगाव के माध्यम से एक विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव के साथ शुरू.
सामान्यतः TETRAD विश्लेषण के रूप में जाना जाता meiotic जीन मैपिंग, खमीर आनुवंशिकी के लिए केंद्रीय है. संक्षेप में, प्रत्येक प्रत्येक गुणसूत्र की एक एक प्रति युक्त दो अगुणित उपभेदों, प्रत्येक गुणसूत्र की दो प्रतियां, प्रत्येक माता पिता से एक के साथ एक विषमयुग्मजी द्विगुणित तनाव फार्म के लिए mated रहे हैं. नाइट्रोजन के लिए द्विगुणित कोशिकाओं को भूख गुणसूत्रों, नकल पुनर्व्यवस्था से गुजरना है, और प्रत्येक माता पिता से alleles के नए संयोजन के साथ चार अगुणित कोशिकाओं (बीजाणुओं या segregants) में विभाजित (sporulation) जिसमें अर्धसूत्रीविभाजन लाती है. एक एकल अर्धसूत्रीविभाजन से उत्पन्न चार बीजाणुओं TETRAD विच्छेदन नामक एक मैन्युअल प्रक्रिया से अलग किया जा सकता है.
1937 4 में मूल प्रकाशन के बाद से अपेक्षाकृत थोड़ा बदल गया है, जो परम्परागत TETRAD विच्छेदन 2,3, तीन लक्ष्य हैं. सबसे पहले, अर्धसूत्रीविभाजन (tetrads) आया है कि कोशिकाओं वनस्पति कोशिकाओं की एक पृष्ठभूमि से दूर अलग किया जाना चाहिए. पारंपरिक विश्लेषण में, इस का उपयोग करते हुए, जो एक शोधकर्ता द्वारा पूरा किया हैएक माइक्रोस्कोप, नेत्रहीन एक अगर प्लेट पर tetrads को दिखाता है और एक micromanipulator तंत्र नेत्रहीन एक अगर प्लेट पर tetrads की पहचान करने और प्लेट की एक सेल मुक्त क्षेत्र पर TETRAD स्थानांतरित करने के लिए एक micromanipulator का उपयोग कर काम करते हैं. अगला, TETRAD में चार बीजाणुओं शारीरिक रूप से interspore संभोग को रोकने के लिए अलग किया जाना चाहिए. एक TETRAD भीतर बीजाणु एक ASCUS, मूल द्विगुणित सेल सेल की दीवार के अवशेष, और interspore पुलों 5 का एक सेट दोनों ने एक साथ आयोजित की जाती हैं. पारंपरिक TETRAD विश्लेषण में ASCUS enzymatic पाचन द्वारा हटा दिया, और एक शोधकर्ता interspore पुल को तोड़ने और बीजाणुओं अलग तंग करने micromanipulator का उपयोग करता है. अंत में, व्यक्तिगत बीजाणुओं बीजाणुओं के बीच रिश्ता रखता है कि एक gridded पैटर्न में arrayed रहे हैं, चार की एक पंक्ति में यानी सभी संतान एक ही मूल TETRAD की बहन बीजाणुओं हैं. एक अनुभवी खमीर शोधकर्ता 10 tetrads (एक आम तौर पर स्वीकार न्यूनतम संख्या विदारक की प्रक्रिया को पूरा कर सकते हैंलगभग 15 मिनट में) पार प्रति.
हम 1 (सर्वोत्तम) टी etrads की nabled एस equencing बी arcode ई जो फोन एक नए उच्च throughput TETRAD जीनोटाइपिंग विधि विकसित किया है. श्रेष्ठ अलग कर रहे हैं कि संतान की बड़ी संख्या, genotyped, और सभी चार meiotic उत्पादों की बहन बीजाणु रिश्तों बरामद करने की अनुमति देता है एक तरह से व्यक्तियों के रूप में बनाए रखा है की पीढ़ी और जीनोटाइपिंग सक्षम करने से उच्च throughput जेनेटिक्स में मौजूदा तरीकों पर फैलता है. यह तीन मुख्य रणनीति (चित्रा 1) का उपयोग कर पूरा किया है. सबसे पहले GFP के साथ अर्धसूत्रीविभाजन आया है कि कोशिकाओं लेबल और उन्हें छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा अलग किया जा करने की अनुमति देता है कि एक पत्रकार के निर्माण की शुरूआत है. दूसरा एक TETRAD के सभी चार बीजाणुओं से फैलता है और पुनः संयोजक progen के डीएनए अनुक्रमण द्वारा पढ़ा जा सकता है कि एक फार्म में एक अत्यधिक जटिल डीएनए बारकोड का समावेश (15 यादृच्छिक nucleotides के एक स्ट्रिंग) हैइस प्रकार y और एक ही TETRAD से बहन बीजाणुओं को पहचानती है. तीसरा जीनोटाइपिंग कदम है, और सबसे अच्छा है कि कब्जा जीनोमिक मार्करों के एक सेट के रूप में अच्छी तरह से TETRAD विशेष बारकोड दोनों कई जीनोटाइपिंग प्लेटफार्म के साथ संगत है. हम इस तरह एक सुसंगत 2-3 संतान उपभेदों के जीनोम का% के साथ ही कब्जा करने, एक प्रतिबंध साइट जुड़े डीएनए टैग अनुक्रमण (रेड-seq) विशिष्ट प्रतिबंध साइटों 1 जीनोम अनुक्रमण कि निर्देशन 6 विधि रोजगार प्लाज्मिड जनित बारकोड . पार से अनुभव से व्युत्पन्न जीनोटाइपिंग डेटा के साथ TETRAD रिश्तों की वसूली कम अनुक्रम कवरेज के साथ मार्कर की स्थिति और inviable (और इसलिए अप्राप्य) व्यक्तियों की पूरी जीनोटाइप सहित लापता जानकारी के सटीक अनुमान की अनुमति देता है. यहाँ, हम meiotic मानचित्रण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सूक्ष्मजीव, खमीर एस में विधि के आवेदन का वर्णन cerevisiae. हालांकि, जीव विशेष वजह से मामूली प्रतिस्थापन के साथमर्द, GFP के लिए जुड़े हुए जैसे विभिन्न sporulation विशेष प्रोटीन, विधि meiotic मानचित्रण गहन या वर्तमान में असभ्य काफी अधिक श्रम है जिसमें जीवों सहित अन्य सूक्ष्मजीवों को आसानी से संक्रमणीय होना चाहिए.
चित्रा 1. सबसे अच्छा तरीका. (ए) pCL2_BC प्लाज्मिड एक sporulation विशेष GFP संलयन, G418 के लिए प्रतिरोध, और एक 15 मेर यादृच्छिक बारकोड के साथ एक 2 माइक्रोन प्लाज्मिड है. प्लाज्मिड पुस्तकालय का निर्माण लुडलो एट अल 1 में वर्णित है. (बी) बारकोड वाले plasmids के एक पूल एक पार से द्विगुणित तनाव में तब्दील हो जाता है. (सी) transformants तब चयन पर हो रहे हैं और ~ 10,000 तब्दील कालोनियों जमा और sporulated रहे हैं. अर्धसूत्रीविभाजन दौरान एक TETRAD की प्रत्येक बीजाणु एक सह संभालतेबारकोड वाले प्लाज्मिड के py. (डी) Tetrads FACS द्वारा unsporulated कोशिकाओं से अलग कर दिया और वे पचा और प्रत्येक बीजाणु एक कॉलोनी बनाने के लिए अनुमति को बाधित कर रहे हैं जहां अगर प्लेटों पर एकत्र कर रहे हैं. (ई) कालोनियों तो, 96 अच्छी तरह प्लेटें में उठाया phenotyped, और genotyped रहे हैं. जीनोटाइपिंग के दौरान प्लाज्मिड बारकोड को पढ़ने और प्रत्येक TETRAD के चार सदस्यों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आंकड़ा लुडलो एट अल 1 से संशोधित किया गया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
जटिल विशेषता मानचित्रण 11 से डीएनए पुनर्संयोजन 12 अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए लेकर आनुवंशिकी अनुसंधान के कई क्षेत्रों, संतान की बहुत बड़ी संख्या है और डीएनए अनुक्रमण की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है. उच्च throughput डीएनए अनुक्रमण की क्षमता के साथ परंपरागत तरीके से बिजली की शादी तकनीक है कि पहले से असभ्य थे कि अध्ययन के लिए सक्षम करने की क्षमता है. कई उच्च throughput खमीर आनुवंशिकी तरीकों विशिष्ट समस्याओं को प्रभावी ढंग से लागू किया गया है, प्रत्येक पारंपरिक TETRAD विश्लेषण के व्यापक प्रयोज्यता की कमी है कि सीमाएं हैं. TETRAD विच्छेदन के संयोजन एक उच्च throughput दृष्टिकोण को रोजगार और खमीर पार की संतान जीनोटाइपिंग द्वारा सर्वश्रेष्ठ पते इन चुनौतियों. मल्टिप्लेक्स रेड टैग अनुक्रमण के साथ संयोजन के रूप में, सबसे अच्छा अनूठा TETRAD बारकोड के माध्यम से TETRAD रिश्तों के संरक्षण, जबकि प्रत्येक संतान तनाव के लिए जीनोटाइप जानकारी बटोरने के लिए एक सस्ता तरीका प्रदान करता है.0; सभी इस समय उच्च तरीकों का इस्तेमाल किया, श्रेष्ठ सबसे निकट एक मैन्युअल विच्छेदित खमीर क्रॉस द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी का स्मरण दिलाता है.
सबसे अच्छा दो प्रमुख विशेषताएं है. पहले तेजी से (प्रोटोकॉल 5-6 कदम) दूर संस्कृति में unsporulated कोशिकाओं से tetrads अलग करने के लिए FACS का इस्तेमाल होता है. फ्लोरोसेंट घटनाओं (tetrads) के हजारों को अलग करने की क्षमता श्रेष्ठ throughput में इसकी सबसे बड़ी लाभ देता है. यह स्वचालन कारण नेत्रहीन दुर्लभ घटनाओं की पहचान करने की जरूरत वृद्धि हुई समय के लिए, कम sporulation दक्षता के साथ पार के लिए मार्गदर्शन विच्छेदन पर एक भी अधिक से अधिक लाभ प्रदान करता है. दूसरा प्रमुख विशेषता एक TETRAD की प्रत्येक बहन बीजाणु से फैलता है कि एक अत्यधिक जटिल आणविक बारकोड (प्रोटोकॉल चरण 2) का इस्तेमाल होता है. इन बारकोड बेतरतीब ढंग से की जरूरत है मैन्युअल रूप से एक आदेश ग्रिड में सरणी कोशिकाओं क्रमशः समाप्त होता है करने के लिए, एक अगर प्लेट भर में वितरित किया गया है कि बीजाणुओं के बीच TETRAD रिश्तों को फिर से संगठित computationally के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में,आणविक बारकोड और sporulation विशेष GFP रिपोर्टर जीन शारीरिक रूप से (एक ही प्लाज्मिड पर) से जुड़े हुए हैं, क्योंकि आणविक बारकोड को बनाए रखा है कि केवल tetrads FACS छँटाई के द्वारा चुना जाता है.
संस्कृतियों sporulation माध्यम में incubated किया जाना चाहिए कि समय की लंबाई को नियंत्रित करने वाले दो विचार कर रहे हैं. Sporulation विशिष्ट रिपोर्टर (SPS2 GFP) जल्दी अर्धसूत्रीविभाजन में व्यक्त किया है क्योंकि सबसे पहले, अकेले GFP अर्धसूत्रीविभाजन (यानी dyads) पूरा नहीं किया है कि कोशिकाओं से पूरा 4-बीजाणु tetrads भेद नहीं करता. अतिरिक्त FACS gating फ्लोरोसेंट, अधूरा tetrads की संख्या कम हो सकती है, वहीं इन अवांछित घटनाओं को कम करने के लिए सबसे आसान तरीका सिर्फ sporulation संस्कृति निगरानी (3.3 चरण) और एक बार नए tetrads बनाने बंद कर दिया है आगे बढ़ रहा है. हमारे प्रयोगों में, हल dyads की आवृत्ति 1% से कम है. दूसरा, आंदोलन के बिना आरटी पर sporulation माध्यम में बिताए कुछ पार अतिरिक्त समय के लिए हस्ताक्षर (3.4 चरण)nificantly वास्तव में, यह कदम कुछ पार के विघटन के लिए बहुत जरूरी है चढ़ाना दौरान ग्लास मनकों द्वारा tetrads की जुदाई ((प्रोटोकॉल चरण 6). सुधार.
सभी उच्च तरीकों की तरह, श्रेष्ठ इसी परंपरागत दृष्टिकोण से "शोर" है. पारंपरिक TETRAD विच्छेदन की तुलना में सर्वश्रेष्ठ में से दक्षता में मामूली कमी कई कारकों के संयोजन से परिणाम सकता है. एक कारक की वजह से प्रक्रिया के यांत्रिक तनाव के बीजाणु मौत प्रसार या बढ़ा दौरान कांच के मोती को आसंजन से परिणाम सकता है, अन्यथा व्यवहार्य बीजाणुओं की वृद्धि की हानि है. एक दूसरा पहलू अर्धसूत्रीविभाजन दौरान सरल प्लाज्मिड नुकसान हो सकता है. एक तीसरा पहलू मिश्रित जीनोटाइप के साथ कालोनियों से उत्पन्न प्रयोग करने योग्य कालोनियों में एक प्रभावी कमी हो सकता है, हमारे पायलट में कालोनियों की अनुमानित ~ 5% 1 पार. यह इन कालोनियों बहन बीजाणु जुदाई की विफलताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं कि संभावना है. क्योंकि तेजी से Fluorescence छँटाई और बीजाणु जुदाई tetrads की भारी संख्या के संग्रह की अनुमति, अच्छा ठीक है इस पैमाने पर दक्षता में कमी दूर करने के लिए सुसज्जित है. सर्वश्रेष्ठ में से भविष्य पुनरावृत्तियों पुस्तिका विच्छेदन आ कि क्षमता में वृद्धि कर सकता है, यह डीएनए अनुक्रमण क्षमता की मौजूदा घातीय प्रक्षेपवक्र तेजी से प्रयोग करने योग्य तनाव घटाने के इस स्तर के लिए क्षतिपूर्ति करेगा कि शायद और अधिक होने की संभावना है. भले ही, सबसे अच्छा लागू किया जा सकता करने के लिए जो पैमाने पर TETRAD विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता वर्तमान में मैनुअल तरीके से unfeasible हैं कि पढ़ाई कर सकेंगे.
The authors have nothing to disclose.
इस काम AMD के लिए एक NIH / NHGRI जीनोम विद्वान / संकाय संक्रमण पुरस्कार (K22 HG002908) और सिस्टम्स बायोलॉजी के लिए संस्थान और लक्जमबर्ग के विश्वविद्यालय के बीच एक रणनीतिक साझेदारी द्वारा समर्थित किया गया. उपभेदों या plasmids के लिए अनुरोध Aimée डुडले (aimee.dudley @ gmail.com) को निर्देश दिया जाना चाहिए.
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |