Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em> Escherichia coli</em>,<em> Salmonella</em> Spp. En<em> Listeria monocytogenes</em> Van grote volumes of Agricultural Water
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Dit protocol beschrijft de snelle colorimetrische detectie van Escherichia coli, Salmonella spp., En Listeria monocytogenes van grote volumes (10 L) van landbouwproducten wateren. Hier wordt water gefiltreerd door steriele Modified Moore swabs (MMS), die bestaan uit een eenvoudige gaasfilter ingesloten in een plastic behuizing, bacteriën concentreren. Na filtratie, zijn niet-selectief of selectief verrijkingen voor de doelbacteriën uitgevoerd in de MMS. Voor colorimetrische detectie van de doelgroep bacteriën, zijn de verrijkingen vervolgens getest met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) ingebed met bacteriën-indicatief substraten. Elk substraat reageert met doelwitspecifieke indicatieve bacteriële enzymen, genereren gekleurde producten die visueel (kwalitatieve detectie) kunnen worden gedetecteerd op de μPAD. Als alternatief kunnen digitale beelden van de gereageerde μPADs worden gegenereerd met gemeenschappelijke scannen of fotografische apparaten en het gebruik van ImageJ software, al geanalyseerdgende voor meer objectieve en gestandaardiseerde interpretatie van de resultaten. Hoewel de biochemische screening procedures tot de bovengenoemde bacteriële pathogenen te identificeren, in sommige gevallen enzymen die door microbiota achtergrond of de afbraak van de colorimetrische substraten produceren vals positief. Daarom wordt bevestigd met behulp van een meer discriminerende diagnose nodig. Toch is dit bacteriële concentratie en detectieplatform is goedkoop, gevoelig (0,1 CFU / ml detectielimiet), gemakkelijk uit te voeren en snel (concentratie, verrijking, en detectie wordt uitgevoerd binnen ongeveer 24 uur), het gebruik als een eerste screeningsmethode rechtvaardigen voor de microbiologische kwaliteit van landbouwproducten water.
Introduction
Het is belangrijk dat voedsel overgedragen ziekten agenten snel en bij voorkeur worden gedetecteerd in het veld op basis van de instellingen om de last van voedsel overgedragen ziekten te verminderen. Gemeenschappelijke strategieën van voedselinfecties bacteriële pathogenen te detecteren omvatten biochemische profilering, selectieve en differentiële kweken, immunologische isolatie en detectie en moleculaire detectie. Echter, deze methoden gehinderd door sporadische besmetting, kleine steekproeven getest, de vaak lage concentraties van de pathogene bacteriën, vereisen lange doorlooptijden, en / of zijn niet van toepassing voor lokale instellingen. Verder verbindingen in veel voedingsmatrices zijn remmend voor detectie en diagnostische toepassingen. Om de kans op microbiële detectie te verbeteren, heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration stelde dat het testen van water voor de landbouw (zoals waswater en irrigatiewater) die ofwel in contact komt met een groot oppervlak van verse producten of dient als een voertuig voor produce besmetting is een levensvatbaar alternatief voor directe testen van levensmiddelen 1. Zelfs zo, de vaak lage natuurlijke pathogeen-belasting in combinatie met het verwateringseffect van de vertegenwoordiger agrarische watermonster maakt vanm pathogeen concentratie essentieel. Een dergelijke methode zou vereisen bemonstering grote hoeveelheden water (≥ 10 L), voldoende pathogeen-concentratie, en compatibiliteit met downstream detectie strategieën.
Gemodificeerde Moore swabs (MMS) zijn goedkoop, eenvoudig en robuust apparaten die worden gebruikt voor het concentreren van bacteriën uit grote volumes (≥ 10 L) water 2-4. De MMS bestaat uit een kunststof cassette gevuld met gaas, dat als een grof filter voor grote volumes water gepompt door de cassette via een peristaltische pomp. De MMS is een niet-discriminerende wijze van bacteriële concentratie (≥ 10 voudige concentratie) dat organische en anorganische deeltjes bestaand materiaal vangt waaronder micro-organismen in verwerkt liquid monsters. Het is waarschijnlijk dat de uitstekende werkzaamheid concentratie van target micro-organismen door de MMS kan worden verklaard door het feit dat micro-organismen zullen naar verwachting worden bevestigd aan de slib-kleifractie of organische micro-aggregaten van de zwevende stoffen 3. Het robuuste ontwerp van de MMS maakt overwinnen meeste tekortkomingen geassocieerd met andere filtratie methoden voor het vangen en concentratie van de bacteriën uit water, zoals verstopping van filters, onvermogen om grote volumes verwerken, filter monsters met hoge troebelheid en hoge kosten. Om deze redenen is de FDA de aanbeveling dat van MMS in officiële procedures voor milieu-en produceren van-gerelateerde monstername procedures 5 worden opgenomen.
Hier wordt een werkwijze beschreven voor de concentratie, verrijking, en detectie van Escherichia coli, Salmonella spp. En Listeria monocytogenes uit agrarische wateren. Een MMS wordt gebruikt voor concentratie van bactEria, en dient ook als een schip voor selectieve of niet-selectieve verrijking van bacteriën. Bacteriële detectie wordt biochemisch bereikt met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) 6. μPADs kunnen worden vervaardigd als fluïde netwerken of spot testen met behulp van verschillende methoden, met inbegrip fotolithografie, inkjet printen, stampen, en wax afdrukken 7-11. Voorbeelden van vloeibare ontwerpen kunnen dendritische kanaalrasters waar het monster wordt aangebracht in het midden en stroomt vervolgens distaal reservoirs of eenkanaals patronen waarbij het monster of substraat uit de buitenste reservoirs van het kanaal worden getrokken door capillaire werking naar het centrum 12. Voor dit protocol, hebben wij ervoor gekozen om in dienst voor 7-mm-diameter van wax-papier spot arrays ingebed met chromogene substraten die kunnen worden verwerkt door enzymen die een indicatie van de hier geteste micro-organismen: Chlorophenol rood β-D-galactopyranoside (CPRG) en 5 – broom-4-chloor-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)voor de detectie van β-galactosidase en β-glucuronidase door E. coli; 5-broom-6-chloor-3-indolyl caprylaat (magenta caprylaat) voor de detectie van C8-esterase door Salmonella spp.; en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-myo-inositol fosfaat (X-InP) voor de detectie van fosfatidylinositol-specifieke fosfolipase C (PI-PLC) door L. monocytogenes 6. Aldus kan de aanwezigheid van een bepaalde bacterie visueel geobserveerd zonder omslachtige apparatuur of data interpretatie. De specificiteit en gevoeligheid van de enzymatische colorimetrische μPAD detectie van deze specifieke doelstelling bacteriën eerder onderzocht 6. Bovendien is de gevoeligheid van de geïntegreerde concentratie-detectiemethode voor deze doelgroep bacteriën werd geëvalueerd door spiking grote hoeveelheden water met vooraf bepaalde niveaus van micro-organismen (ongepubliceerde gegevens en Bisha et al.. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een geïntegreerde werkwijze voor het detecteren E. coli, Salmonella spp. en L. monocytogenes in landbouwproducten water. Hier, MMS concentratie van de bacteriën uit grote volumes (10 L), van de landbouw water, is gekoppeld met bacteriële verrijking, en bacteriële-indicatieve colorimetrische detectie met behulp μPADs. De MMS procedure kan omgaan met hoge deeltjes gehalte in het water monsters terwijl concentreren van de bacteriën 10-voudig, is robuust en eenvoudig genoeg vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
