En Full huddefekt modell for å evaluere vaskularisering av biomaterialer<em> In Vivo</em

Summary

Vascularization er nøkkelen til tilnærminger i vellykket tissue engineering. Derfor er pålitelige teknologier som kreves for å vurdere utviklingen av vaskulære nettverk i vev-konstruksjoner. Her presenterer vi en enkel og kostnadseffektiv metode for å visualisere og kvantifisere vascularization in vivo.

Abstract

Utilstrekkelig vascularization anses å være en av de viktigste faktorene som begrenser den kliniske suksessen vev-konstruert konstruksjoner. For å vurdere nye strategier som tar sikte på å bedre vascularization, er pålitelige metoder som kreves for å gjøre in-vekst av nye blodkar i bio-kunstig stillaser synlige og kvantifisere resultatene. I løpet av de siste par årene, har vår gruppe innført et komplett hud defekt modell som gjør det mulig direkte visualisering av blodårer ved transilluminasjon og gir mulighet for kvantifisering gjennom digital segmentering. I denne modellen, en kirurgisk skaper komp hud defekter i ryggen av mus, og erstatter dem med materialet som testes. Molekyler eller celler av interesse kan også bli innarbeidet i slike materialer for å undersøke deres potensielle effekt. Etter en observasjonsperiode på ens eget valg, er materialer Eksplanterte for evaluering. Bilaterale sår gi muligheten for å gjøre interne sammenligninger thpå minimere gjenstander blant enkeltpersoner så vel som for å redusere antall dyr som trengs for studien. I forhold til andre metoder, vår fremgangsmåte gir en enkel, pålitelig og kostnadseffektivt analyse. Vi har implementert denne modellen som en rutinemessig verktøy for å utføre høy oppløsning screening ved testing vascularization av ulike biomaterialer og bio-aktiverings tilnærminger.

Introduction

I de siste tiårene har tissue engineering åpnet opp en ny terapeutisk alternativ for å erstatte vev defekter med kroppens egne celler ^en. For å støtte den fysiologiske prosessen med vev gjenfødelse, er stillasene utformet som et biologisk nedbrytbart struktur, som gir et scenario der celler fra sårbunnen kan vokse og gjenopprette feilen ^2,3.

Utilstrekkelig vascularization er ansett å være den viktigste hindringen, som holder tilbake den kliniske gjennombrudd bioartificial stillaser ^fire. Med innvekst av celler, blir behovet for næringsstoffer og oksygen øker og vaskularisering av materialet viktig. Utilstrekkelig eller forsinket vascularization kan derfor føre til sentral nekrose av vev-utviklet produkter ^fem. I tillegg blodkar gi immun kompetente celler og fjerne de metabolske rester i regenererende området. Høye infeksjonsrater og lav regenerering er barenoen av konsekvensene av utilstrekkelig blod perfusjon observert i tissue engineering, som har som mål å være avverget ved å øke vaskularisering av stillasene ^6,7.

Flere strategier som tar sikte på å bedre vascularization fokus på den viktige rollen av biomateriale selv og mikrostrukturen av stillaset. Det er intensiv forskningsinnsats for å utvikle nye tilnærminger i skiftende helbredelsesprosessen fra reparasjon til regenerering, og dermed (re) genererer en vev med de nærmeste fysiologiske egenskapene til en å bli restaurert ^8,9. Biomaterialer som ble studert og vurdert med hensyn til deres regenererende potensial inkludert kollagen, fibrin, kitosan og alginat ^10,11. Disse biomaterialer kan brukes og kombineres som en ryggrad for å bygge nye stillasene ved hjelp av ulike strategier som vev decellularization, selvbygging, rapid prototyping og electro ^12. For å ENHning kroppens egen evne til reproduksjon, kan stillaser bli bioactivated. Inkorporering av rekombinant angiogen vekstfaktorer ¹³ eller gen-vektorer som koder for slike faktorer som ¹⁴ har vist seg å forbedre vaskulariseringen av stillaset. Bruken av stamceller har blitt mye vist seg å være en lovende strategi for å forbedre vaskulariseringen, hvor mesenchymale stromale celler og endoteliale stamceller har fått mest oppmerksomhet ^15,16. Andre tilnærminger forsøke å bygge konstruksjoner som inneholder prefabrikkerte fartøy nettverk før transplantasjonen ^17. Til tross for intensiv innsats i stillaset utforming og deres bio-aktivering, har ingen strategi forbedret vascularization på et klinisk signifikant nivå, og med unntak av dermal utskiftninger i massive brannskader, er oversettelsen av bioengineered materialer inn i klinisk rutine bare foregår nølende ¹⁸ .

En av grunnene til at vascularizationav kunstig vev konstruerer er fortsatt et uløst problem, er vanskeligheten for å vurdere effekten av ny teknologi i in vivo tilnærminger. Selv om in vitro eksperimenter kan gi viktig innsikt i vaskularisering potensialet av stillas, er egnede dyremodeller som kreves for å studere viktige parametere som biokompatibilitet av materialet, sikkerheten og effektiviteten av behandlingen, og av særlig betydning, at vaskularisering i vevet konstruere. Derfor, for å pålitelige verktøy visualisere og kvantifisere blodårer nettverk in vivo er avgjørende.

I denne studien presenterer vi en enkel og pålitelig metode som gjør det mulig for visualisering og kvantifisering av det vaskulære nettverket inne eksplanterte stillaser. Denne metoden er basert på vev transilluminasjon og digital segmentering. Etter denne metode er ikke-invasiv, tillater det ytterligere molekylære og histologiske analyser av målet materiale.

Protocol

1. Utarbeidelse av stillas Generere prøver av stillasene ved hjelp av 12 mm biopsi stempler. Å introdusere bioaktive molekyler eller celler i stillaset, avløp stillasene ved å klemme forsiktig dem med en steril kompress. Deretter rehydrere stillasene ved å tilsette 160 pl av en oppløsning inneholdende de biologisk aktive molekyler eller celler av interesse. Dobbeltsjekk suksessen bioaktive med celler gjennom metabolske analyser som MTT-analyser. Hvis det er nødvendig, fikse forbinde…

Representative Results

En pålitelig bilateral fulle huddefekt kan opprettes i mus (figur 1) hvor huden kan bli erstattet av et biomateriale under studien (figur 2). Her er ingen store komplikasjoner observert under eller etter operative prosedyren, verken makroskopiske tegn på infeksjon eller fremmedlegeme reaksjon. I sjeldne tilfeller blir et stillas tapt når en mus fjerner den. Sår sammentrekning ble aldri observert (figur 3). Tissue transilluminasjon tillates klar visualisering av vask…

Discussion

Det er behov for å etablere vellykkede tilnærminger i å forbedre blodperfusjon i vev konstruert konstruerer, som krever utvikling av nye pålitelige metoder for å studere vascularization prosesser innenfor biomaterialer. Vanlige metoder for fremstilling av stillaset vaskularisering ex vivo synlig omfatter bruk av mikroskopi, noe som gir en høy oppløsning verktøyet. I de fleste tilfeller, er imidlertid denne fremgangsmåte begrenset til analyse av små vevsområder og har en tendens til å være kostbart …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8 'x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesove drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10