Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller
Summary
Målretting hjerne-resident celler for direkte avstamning-omprogrammering gir nye perspektiver for hjernen reparasjon. Her beskriver vi en protokoll for hvordan du kan forberede kulturer beriket for hjerne-resident pericytes fra voksent menneske cerebral cortex og konvertere disse til induserte nevroner av retrovirus-mediert uttrykk for transkripsjonsfaktorene Sox2 og Ascl1.
Abstract
Direkte avstamning-omprogrammering av ikke-nevronale celler til indusert nevroner (INS) kan gi innsikt i de molekylære mekanismene bak neurogenesis og aktivere nye strategier for in vitro modellering eller reparere den syke hjernen. Identifisere hjerne-resident ikke-nevronale celletyper mottagelig for direkte konvertering til ins kan gi rom for å lansere en slik tilnærming i situ, dvs innen skadet hjernevev. Her beskriver vi en protokoll utviklet i forsøket på å identifisere celler avledet fra den voksne menneskehjernen som oppfyller denne forutsetningen. Denne protokoll omfatter: (1) dyrking av humane celler fra den cerebrale cortex erholdt fra voksne humane hjernebiopsi; (2) in vitro-ekspansjon (ca. kreve 2-4 uker) og karakterisering av kulturen ved immunocytokjemi og flowcytometri; (3) anrikning av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) under anvendelse av anti-PDGF-reseptor-β-og anti-CD146 antistoff;(4) retrovirus-mediert transduksjon med nevrogen transkripsjonsfaktorer Sox2 og ascl1; (5) og til slutt karakterisering av de resulterende pericyte-avledet indusert nevroner (PdiNs) etter immunocytokjemi (14 dager til 8 uker etter retroviral transduksjon). På dette stadiet, kan Ins bli analysert for deres elektriske egenskaper av patch-clamp opptak. Denne protokollen gir en svært reproduserbar prosedyre for in vitro avstamning konvertering av hjerne-resident pericytes i funksjonelle menneskelige ins.
Introduction
I motsetning til omprogrammering av somatiske celler i indusert pluripotente stamceller (iPSCs), som i sin tur er utstyrt med en mengde differensiering potensialer, sikter direkte reprogrammering for direkte omdannelse av en spesifikk celletype til en annen. Med hensyn til deres anvendelse i sammenheng med sykdommen modellering og eventuelle celle-baserte terapier, både omprogrammering tilnærminger har spesielle fordeler og ulemper. Omprogrammering inn iPSCs (i) gir en tilnærmet uendelig kilde av celler; (Ii) gir mulighet for genteknologi; (Iii) endows med en nesten ubegrenset differensiering potensial. Imidlertid store ulemper ved iPSCs medføre risiko for tumorgenisitet av udifferensierte celler (teratom dannelse in vivo), og behovet for ex vivo dyrking og påfølgende transplantasjon hvis disse celler skal anvendes for celle-baserte terapier. Omvendt, er direkte lineage-omprogrammering er begrenset av den nedre utbyttet av de ønskede cellenesom korrelerer direkte med antallet av de målrettede celler i utgangs befolkningen, men har den fordel at lineage-omprogrammeres cellene ser ut til å oppvise ingen tumorigen risiko ved transplantasjon 1,2; Videre kan direkte reprogrammering også bli oppnådd in situ, dvs. inne i organet hvor disse celler ville være nødvendig, for derved å unngå behovet for transplantasjon.
Med dette i bakhodet, har vår lab forfulgt muligheten for avstamning-omprogrammere hjernen-resident celler inn ins som en ny tilnærming mot celle-baserte terapier av nevrodegenerative sykdommer. Hjerne-resident celler som kan være potensielt anses som cellulære mål for avstamning-omprogrammering omfatter ulike typer macroglia (astrocytes, NG2 celler og oligodendrocytes), microglia, og microvessel-assosiert celler (endotelceller og pericytes). Vi har grundig studert in vitro omprogrammering potensialet astroglia av cerebral cortex av tidlig postnatal mus 3-5. På jakt etter tilsvarende egnede celle kilder for direkte avstamning-omprogrammering i den voksne menneskehjernen, møtte vi en cellepopulasjon som kan være vellykket omprogrammeres til ins og utstilling kjennetegnene ved pericytes. Her beskriver vi en protokoll for å høste slike celler fra voksne humane hjernebiopsi, for å utvide og berike disse cellene in vitro, og til slutt med hell omprogrammere en vesentlig del av disse in vitro-ekspanderte celler (i området fra 25 til 30%) i INS. Omprogrammering kan oppnås ved samtidig retrovirus-mediert co-uttrykk for to transkripsjonsfaktorer, Sox2 og ascl1. Disse PdiNs ble funnet å tilegne seg evnen av repeterende handling potensial avfyring og å tjene som synaptiske mål for andre nerveceller som indikerer deres evne til å integrere inn i nevrale nettverk. Vår protokollen gir en enkel prosedyre for isolering og avstamning konvertering av voksne menneskelige hjerne pericytes inn ins. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver in vitro utvidelse og berikelse av pericyte-avledet celler følgende isolasjon fra voksent menneske cerebral cortex og senere konvertering til moduler ved retrovirus-mediert uttrykk for nevrogen transkripsjonsfaktorene Sox2 og Ascl1. En slik protokoll gir en eksperimentell in vitro system for å studere avstamning-konvertering av hjerne-bosatt celler i nevroner og potensielt også gliaceller, med målet i tankene til slutt oversette dette direkte konvertering tiln?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Dr. Magdalena Götz for hennes innspill under utviklingen av denne protokollen. Vi takker Dr. Marius Wernig (Stanford University) for sjenerøst å gi oss med Sox2 koding sekvensen. Vi er også svært takknemlige til Dr. Alexandra Lepier for virusproduksjon. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) og BMBF (01GN1009A) til BB, og den bayerske stats Ministry of Sciences, forskning og kunst til MK og BBCS fått støtte fra binational SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tysk og slovensk Federal Ministries Utdannings-og forskningsdepartementet) og DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
