Method Article

Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme Medicago truncatula Kök Nodüller

DOI:

10.3791/51434

⸱

March 5th, 2014

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kitle spektometrik görüntüleme (MSI), biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar sağlayabilir kendi doğal ortamlarında bileşikleri koruyarak, sağlam dokularda çeşitli kimyasal türler keşfetmek ve tanımlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Burada küçük moleküllerin analizi için geliştirilmiş bir MSI yöntem tarif edilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

, Bu tür ilaçlar ya da endojen metabolit olarak küçük moleküller, çalışma potansiyel olarak 1 çalışılmaktadır metabolik yollar değişikliklere neden olabilir, ilgi konusu doku homojenizasyon gerektiren doku özleri istihdam için kullanılan çoğu teknikleri. Kitle spektometrik görüntüleme (MSI) biyolojik doku örneklerinin 1-5 bozulmamış dilimleri içinde Analitlerin mekansal bilgi verebilir güçlü bir analitik araçtır. Bu teknik, proteinler, peptitler, lipidler ve bu endojen metabolitler gibi küçük moleküller de dahil olmak üzere bileşiklerin çeşitli incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI)-MSI ile, birden fazla metabolit uzaysal dağılımı, aynı anda tespit edilebilir. Burada, baklagil kök ve kök üzerindeki nodüllerde hedefsiz metabolomiks MSI deneyler için özel olarak geliştirilmiş bir yöntem gerçekleşen biyolojik süreçlerin içine anlayışlar ortaya koyabilir sunulmuştur.yöntem Burada sunulan numune hazırlama görüntü edinimi, tipik bir MSI iş akışını gösterir ve küçük molekülleri tespit için yararlı birçok matris uygulama tekniklerini gösteren, matris uygulama adım üzerinde duruluyor. MS görsel üretildikten sonra, ilgi konusu metabolitlerin analizi ve tanımlanması tartışılan ve gösterilmiştir. Burada sunulan standart iş akışı kolayca farklı doku tiplerinin moleküler türler ve enstrümantasyon için modifiye edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolitler ve büyüyen alan biyobelirtecin keşif, bitki ve diğer biyolojik sistemlerde metabolik yolları deşifre ve toksikoloji profil 4,6-10 dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik uygulamalar vardır. Biyolojik sistemleri inceleyerek önemli teknik zorluk onlara 11 aksatmadan metabolomic yolları incelemektir. MALDI-MSI tek organlar 12,13 ve hatta tek hücre 14,15 analitlerin hassas algılama sağlar dokulara doğrudan analizi sağlar.

Örnek hazırlama, güvenilir ve tekrarlanabilir kütle spektral görüntüler üretiminde çok önemli bir adımdır. Görüntülerin kalitesi büyük ölçüde, doku gömme ortamı, dil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Aletler

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. Küçük moleküllerin analizi için bir MALDI kaynağı ile donatılmış bir kütle spektrometresi (Malzeme / Ekipmanları bkz. Tablo) kullanın. Ilgi Analitlerin bağlı olarak pozitif ya da negatif iyon modunda satın almalar gerçekleştirin. Ilgi konusu bir kitle aralığını belirleme ve iyon görüntüleri oluşturmak için numunenin yüzeyi boyunca x ve y boyutları hem de 50 um aralıklarla 500 lazer vuruşla / nokta toplar. Lazer çekim raster genişliği ve sayısı, sırasıyla daha yüksek uzamsal çözünürlük ve maksimum sinyal yoğunluğu elde etmek için ayarlanabilir. DHB matris tepe ya da kütle spektrumu kalibre etmek için slayt ya....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSI Deneysel bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Deneyin başında, numune hazırlama kritik bir adımdır. Nodüller bitki kökünden kesilmiş ve jelatin gömülür. Dondurulmuş edilirken doku, herhangi bir kabarcıkları ile, kriyostat fincan karşı bastırılmış olması gerekir, bu bölümlere edilirken bu doku daha kolay ve düzgün hizalama temin edecektir. Doku dilimlenmiş edilirken, bu, uygun kalınlıkta doku kesmek için önemli olan, çok kalın bölümden çıkarılan ve doku tespit analitlerin sayısını azaltacakt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tartışıldığı gibi, örnek hazırlama MSI akışı en kritik adımdır. Dengesiz doku gömme bazı durumlarda olası zor ya da olmamak Kesit neden olacaktır. Kesit boyutu ve yeterli dengeleme zamanı doku bütünlüğünün korunması ve katlama ve gözyaşları kaçınarak için çok önemlidir. Matris ve uygulama tekniği seçimi tespit edilecek analitlerin türlerini belirlenmesinde rol, uzamsal çözünürlük ve sonuçların tekrar elde edilebilirliğini oynayacaktır. Matrisler veya uygulama teknikleri bir arada kullanmak tamamlayıcı sonuçlar .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Medicago truncatula örnekleri sağlamak için UW-Madison Tarla Bitkileri Bölümü'nde Dr Jean-Michel Ane kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF) fon tarafından kısmen desteklenen hibe CHE-0957784, Wisconsin Üniversitesi Enstitüsü ve Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı (warf) ve Romnes Fakültesi Araştırma Bursu programı (LL). EG, bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (DGE-1256259) kabul eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
JelatinDifco214340çözünmesi için ısıtın
Kriyostat- HM 550Thermo Scientific956564A
İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı cam slaytlar Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0,8 mm (genişlik x uzunluk x kalınlık)
2,5-Dihidroksibenzoik asit (DHB) matrisi ICN Biyomedikal<a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx? ItemID=1787195">PI90033
AirbrushPaasche Airbrush CompanyTG-100D75 ml çelik kap ile birleştirilmiş
Otomatik matris püskürtme sistemi- TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX. TMSP'yi seçin. H021-UCihaz kurulduğunda özel başlatma ve kapatma talimatları verilecektir
Süblimasyon aparatı Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Vakum pompası- Alcatel 2008 Aİdeal Vakum ÜrünleriP10976Nihai Basınç = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
FlexImagingBruker Daltonics269841"Satıcıya özel yazılım"a bir
örnekMALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZDoğru kütle ölçümleri için yüksek çözünürlüklü MALDI cihazı
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRDoğru kütle ölçümleri için yüksek çözünürlüklü LC-MS cihazı
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope. J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).
  2. van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MALDI Mass Spectrometric ImagingMetabolite DetectionMedicago truncatulaRoot NodulesTissue SectioningMatrix ApplicationAirbrush SprayingSublimation TechniqueIon Image AnalysisMetabolite Identification

Related Articles