Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Summary

Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici.

Abstract

Strumenti che consentono l'applicazione di forze meccaniche alle cellule e tessuti o che possono quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mechanobiology base. Queste tecniche sono stati ampiamente utilizzati per dimostrare come l'insorgenza e la progressione di diverse malattie sono fortemente influenzati da stimoli meccanici. Questo articolo presenta un allungamento biassiale (BAXS) piattaforma multi-funzionale che può sia stimolare meccanicamente le cellule singole o quantificare la rigidità meccanica dei tessuti. La piattaforma BAXS consiste di quattro motori voice coil che possono essere controllati in modo indipendente. Singole cellule possono essere coltivate su un substrato flessibile che può essere collegato ai motori permettendo di esporre le cellule a campi di deformazione complessi, dinamici e spazialmente variabili. Viceversa, incorporando una cella di carico forza, si può anche quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti primari come sono esposti a cicli di deformazione.In entrambi i casi, un adeguato sistema di aggancio deve essere progettato e montato ai motori piattaforma BAXS per trattenere saldamente il substrato flessibile o tessuto di interesse. La piattaforma BAXS può essere montato su un microscopio invertito effettuare simultanea luce trasmessa e / o fluorescenza per esaminare la risposta strutturale o biochimica del campione durante gli esperimenti di stretching. Questo articolo fornisce dettagli sperimentali di progettazione e l'utilizzo della piattaforma BAXS e presenta risultati per singola cella e gli studi di tutto il tessuto. La piattaforma BAXS stato usato per misurare la deformazione di nuclei in cellule singole topo mioblasti in risposta al substrato ceppo e per misurare la rigidità di isolato aorte topo. La piattaforma BAXS è uno strumento versatile che può essere combinato con vari microscopia ottica al fine di fornire nuovi approfondimenti mechanobiological ai livelli tissutali sub-cellulari, cellulari e complesso.

Introduction

Il microambiente meccanica svolge un ruolo importante in molte funzioni cellulari come la proliferazione, migrazione e differenziazione, che hanno un profondo impatto nello sviluppo e omeostasi dei tessuti e anche in malattie ^1-6. Nel corso degli anni, una moltitudine di strumenti sperimentali sono stati utilizzati per stimolare meccanicamente cellule o tessuti e misurare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici con l'obiettivo di aumentare la nostra comprensione di mechanobiology base e studiando l'insorgenza e la progressione delle malattie ^6-17. Tuttavia, si deve spesso basarsi su varie differenti dispositivi sperimentali per conseguire ....

Protocol

1. Deformazione meccanica di singole cellule

1. Realizzazione di un substrato PDMS con perline fluorescenti incorporati
   Prima di montaggio del substrato, microsfere fluorescenti in soluzione acquosa vengono risospese in isopropanolo per migliorare perla di miscelazione nelle PDMS dovute alla natura idrofoba.
   1. Pipettare 500 ml di microsfere fluorescenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 16.200 xg per 10 min.
   2. Eliminare il surnatante e aggiungere 500 ml di isopropanolo seguito con 5 min di vortex. Mettere il flaconcino da parte una notte al buio, al fine di consentire eventuali particelle più grandi aggregati a ....

Results

Cella Stretching

La piattaforma BAXS stato usato per studiare la risposta meccanica del nucleo in cellule singole topo mioblasti (C2C12) esposta a una deformazione substrato del 25%. Mioblasti si trovano nel tessuto muscolare e sono costantemente esposti a stiramento meccanico e compressione in vivo. Le proprietà di forma e meccaniche del nucleo cellulare hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica e l'attività trascrizi.......

Discussion

La piattaforma BAXS qui presentato facilita numerosi esperimenti nello studio di mechanobiology, dalle indagini di singole cellule ai tessuti interi. Inoltre, la piattaforma è altamente flessibile e configurabile, consentendo numerosi esperimenti di stimolazione meccanici e prove di trazione multiassiale. La piattaforma consente anche la manutenzione di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche e permette di microscopia simultanea durante gli esperimenti di stretching. I due esperimenti descritti nelle sezioni preced.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Il rapporto tra base e reticolante utilizzato in questo protocollo è 20:1. Mescolare in una cappa laminare per evitare che la polvere contamini il tuo
Microsfere fluorescenti FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Tenere lontano dalla luce.
Bobina mobile lineare	Moticont	LVCM-051-051-01	Il motro è disponibile in due pezzi (magnete e bobina). Deve essere montato su un sistema con cuscinetti a sfera per essere funzionale.
Guida con cuscinetti	a sfera Edmund Optics	NT37-360	Slitte con cuscinetti a sfere a movimento lineare miniaturizzato e di piccole dimensioni
Stadio di posizionamento lineare	Edmund Optics	38-960	Azionamento centrale Stadi di traslazione lineare quadrati da 1,25"
Encoder ottico	Sistemi GSI microE	Mercury II 1600S -	Encoder incrementale riflettente
Controllore di movimento	Galil	DMC-2143(DIN)-DC48 con AMP-20440	Controllore a 4 assi con amplificatore a 4 assi
Cella di carico	Honeywell	31 a bassa	miniatura con una gamma di 0-150 g
Perni minuziosi per insetti (0,20 mm)	Pin Service Austerlitz Perni		Perni in acciaio inossidabile piegati a forma di triangolo aperto
SU-8 2050	Micro Chem	SU-8 2050	Fotoresist negativo epossidico permanente. Tenere lontano dal calore e dalla luce
Sistema di trattamento al plasma ad aria	Glowresearch		Autoglow Oxygen Plasma System
Collagene a coda di topo	Invitrogen	A10483-01	Collagene I, coda di ratto 5 mg/ml
Hoechst 33342	Invitrogen	R37605	Colorante fluorescente specifico per il DNA. Conservare in frigo.
Riscaldatori flessibili isolati in Kapton (film di poliimmide)	omega.ca	riscaldatori flessibili KHLV-0504/(10)-P	da 28 V; possono essere forniti con un
regolatore di temperatura e processo Autotune da 24 V 1/16 DIN	omega.ca	CN63200-R1-LV	Regolatore di temperatura; alimentazione 24 V.
Terreno di coltura DMEM	Hyclone	SH3024301	Dulbecco' s 30 Eagle Medium modificato. Mantieni a 4 ° C
Penicillina-Streptomicina	Hyclone	SV30010	Mantenere il brodo congelato. Mantenere la soluzione funzionante a 4 °C.
Siero fetale bovino (FBS)	Clone	SH3039603C	Conservare congelato.
Tripsina 0,05%	Hyclone	SH30236,02	Tenere congelato. Digestione delle proteine di attaccamento cellulare per la subcoltura
Hepes	Wisent Inc	330-050-EL	Soluzione salina tamponata HEPES
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1	Soluzione salina tamponata HEPES / Soluzione fisiologica Krebs
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	Soluzione salina tamponata HEPES / Soluzione fisiologica Krebs
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500	Soluzione salina tamponata HEPES / Soluzione fisiologica Krebs
CaCl2	Fisher Scientific	C614-500	Soluzione salina tamponata HEPES / Soluzione fisiologica Krebs
Destrosio	Fisher Scientific	BP220-1	Soluzione salina tamponata HEPES / Soluzione fisiologica Krebs
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1	Soluzione fisiologica Krebs
KH2PO4	Fisher Scientific	BP362-500	Soluzione fisiologica di Krebs
Carbogen 95% O2/5% CO2	Lindle	DIN:02154749	Ossigenazione in soluzione fisiologica di Krebs
Nocodazole	Sigma	M1404	Agente di depolimerizzazione dei microtubuli
Cytochalasin-D	Sigma	C8273	Agente di depolimerizzazione dei filamenti di actina
Anti-α- SMA-FITC	Sigma	F3777	Utilizzato per colorare e quantificare il contenuto di cellule muscolari lisce
Colorazione rossa Picrosirius	Fluka	43665	Utilizzato per colorare e quantificare il contenuto di collagene