राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation द्वारा Polyribosome (polysome) विभाजन एक जीनोम व्यापक पैमाने पर व्यक्तिगत mRNAs का अनुवाद क्षमता का प्रत्यक्ष निर्धारण की अनुमति देता. इसके अलावा, इस पद्धति ऐसी संरक्षिकाओं और संकेतन अणुओं के रूप में राइबोसोम और polysome जुड़े कारकों की जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
mRNA अनुवाद जीन अभिव्यक्ति के नियमन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है और स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. तदनुसार, mRNA अनुवाद के अनियंत्रण कैंसर सहित रोग राज्यों की एक किस्म में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है. राइबोसोम भी जिससे समारोह और नव संश्लेषित polypeptides की स्थिरता नियमन करने, नवजात polypeptides के तह की सुविधा जो संरक्षिकाओं, मेजबानी. इसके अलावा, उभरते डेटा राइबोसोम संकेत वे राइबोसोम से उभरने के रूप में नए संश्लेषित polypeptides के बाद translational संशोधनों की एक किस्म में फंसा रहे हैं जो अणुओं, और / या translational मशीनरी के घटकों में से एक प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मंच के रूप में सेवा है कि संकेत मिलता है. इस के साथ साथ, सूक्रोज घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग राइबोसोम विभाजन की एक अच्छी तरह से स्थापित विधि वर्णित है. घर में विकसित "anota" एल्गोरिथ्म के साथ संयोजन के रूप में इस विधि की अनुमति देता है diffe के प्रत्यक्ष निर्धारणएक जीनोम व्यापक पैमाने पर व्यक्तिगत mRNAs का rential अनुवाद. इसके अलावा, इस बहुमुखी प्रोटोकॉल नए संश्लेषित polypeptides की तह और गिरावट में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं कि उन सहित राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों, के समारोह को काटना लक्ष्य जैव रासायनिक अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित कि विनियामक नेटवर्क बड़े पैमाने पर पिछले दो दशकों में अध्ययन किया गया है. एक जीनोम व्यापक पैमाने पर स्थिर राज्य mRNA स्तर में परिवर्तन तथाकथित "जीन अभिव्यक्ति" प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया जिससे transcriptional विनियमन, पर ध्यान केंद्रित इन अनुसंधान के प्रयासों के विशाल बहुमत. हाल के अध्ययनों से स्थिर राज्य mRNA स्तर केवल शिथिल जिससे mRNA अनुवाद सहित बाद transcriptional तंत्र, जीन अभिव्यक्ति 3,4 के नियमन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, यह दर्शाता है proteome 1,2 की रचना करने के लिए संगत प्रकट करते हैं. दरअसल, यह ~ प्रोटीन के स्तर का 50% अमर माउस fibroblasts 5 में mRNA अनुवाद के स्तर पर निर्धारित कर रहे हैं कि अनुमान लगाया गया है.
mRNA अनुवाद mRNAs करवाया राइबोसोम, स्थानांतरण RNAs (tRNAs) की कार्रवाई और सहायक कारकों सह के माध्यम से प्रोटीन में अनुवाद कर रहे हैं, जिसके दौरान एक उच्च विनियमित प्रक्रिया हैmmonly अनुवाद कारकों (TFS) 6 के रूप में भेजा. प्रोटीन संश्लेषण स्तनधारी कोशिकाओं 7 में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है और इसलिए वैश्विक mRNA अनुवाद दरों पोषक तत्वों की उपलब्धता और सेल प्रसार दरें 8 को समायोजित करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. वैश्विक mRNA अनुवाद एक्सचेंज, विभिन्न बाह्य उत्तेजनाओं (जैसे हार्मोन और वृद्धि कारकों), intracellular cues (जैसे अमीनो एसिड का स्तर) और तनाव के विभिन्न प्रकार (जैसे ईआर तनाव) कर रहे हैं कि mRNAs के पूल में चयनात्मक परिवर्तन प्रेरित में परिवर्तन के अलावा (translatome) 6 अनुवाद किया जा रहा. प्रोत्साहन के प्रकार, कुछ का अनुवाद गतिविधि नहीं, बल्कि सभी mRNAs नाटकीय रूप से इस तरह एक तेजी से सेलुलर प्रतिक्रिया 6 माउंट करने के लिए आवश्यक हैं कि proteome में परिवर्तन के परिणामस्वरूप, प्रभावित कर रहे हैं पर निर्भर करता है. Translatome में ये गुणात्मक और मात्रात्मक परिवर्तन के पार अभिनय कारकों के बीच परस्पर क्रिया (द्वारा मध्यस्थता माना जाता है जैसे </उन्हें> translational मशीनरी, सहायक कारकों या miRNAs) और mRNAs 6,9 के चयनित सबसेट में मौजूद सीआईएस तत्वों (आरएनए तत्व या सुविधाओं) के घटकों. उदाहरण के लिए, स्तर और / या दर सीमित अनुवाद दीक्षा की गतिविधि में परिवर्तन eIF4E और eIF2 चुनिंदा विशिष्ट 5'UTR सुविधाओं 6 पर आधारित टेप के अनुवाद मिलाना कारकों. eIF4E और eIF2 क्रमश: 6, राइबोसोम के लिए mRNA और सर्जक tRNA की भर्ती के लिए आवश्यक हैं. EIF4E गतिविधि में वृद्धि के चुनिंदा cyclins, सी Myc और बीसीएल एक्सएल 10 सहित प्रोटीन उत्तेजक उन एन्कोडिंग प्रसार और अस्तित्व सहित लंबी और उच्च संरचित 5'UTRs शरण mRNAs का अनुवाद bolsters. बदले में, eIF2 की निष्क्रियता चुनिंदा ऊपर इस तरह उन एन्कोडिंग मास्टर टी के रूप में उनके 5'UTRs में कम निरोधात्मक नदी के ऊपर खुला पढ़ने फ्रेम (uORFs), युक्त mRNAs का अनुवाद को विनियमित करने, whilst एक वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण बंद नीचे की ओर जाता हैप्रोटीन प्रतिक्रिया सामने आया (जैसे ATF4) की ranscriptional नियामकों. पोषक तत्वों, वृद्धि कारक है और हार्मोन, rapamycin के यंत्रवत / स्तनधारी लक्ष्य MAPK मार्ग सीधे phosphorylates जबकि (mTOR) मार्ग, 4E बाध्यकारी प्रोटीन अनुवाद दमन की (4E-BP) परिवार निष्क्रिय द्वारा eIF4E गतिविधियों को बढ़ावा देने सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में 6,11 eIF4E. बदले में, eIF2α kinases (यानी अतिरिक्त लाभ PKR, HRI और GCN2) पोषक अभाव, ईआर तनाव और वायरस के संक्रमण 6,12 के जवाब में अपनी eIF2α विनियामक सबयूनिट phosphorylating द्वारा eIF2 रोकना. TFS की गतिविधि और / या अभिव्यक्ति में परिवर्तन, translational मशीनरी और miRNAs सहित विनियामक कारकों के अन्य घटकों के कैंसर, चयापचय सिंड्रोम, तंत्रिका विज्ञान और मनोरोग विकार, और गुर्दे और हृदय रोगों 13-19 सहित विभिन्न रोग राज्यों में मनाया गया है. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों है कि मुझे translational का संकेतchanisms सेल homeostasis को बनाए रखने में और उनके निराकरण विभिन्न मानव रोगों के एटियलजि में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है कि एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं.
इस के साथ साथ, monosomes, ribosomal सब यूनिटों और दूत Ribonucleoprotein कणों (mRNPs) से polysomes अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो स्तनधारी कोशिकाओं में सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation द्वारा polysomes के विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस खराब अनुवादित (प्रकाश polysomes से जुड़े) mRNAs से (भारी polysomes से जुड़े) कुशलता से अनुवादित बीच भेदभाव सक्षम बनाता है. इस परख में, राइबोसोम ऐसे cycloheximide 20 और साइटोसोलिक अर्क ultracentrifugation द्वारा 5-50% रैखिक sucrose gradients घनत्व पर अलग हो रहे हैं के रूप में अनुवाद बढ़ाव inhibitors का उपयोग mRNA पर स्थिर रहे हैं. सुक्रोज ढ़ाल के बाद fractionation वे करने के लिए बाध्य राइबोसोम की संख्या के हिसाब से mRNAs का अलगाव की अनुमति देता है. प्रत्येक अंश से निकाले आरएनए तो निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैविभिन्न परिस्थितियों के बीच ढाल भर mRNAs का वितरण में परिवर्तन, जिससे ढाल के ऊपर से नीचे तक translational क्षमता बढ़ जाती है. उत्तरी सोख्ता या मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT-पीसीआर) प्रत्येक अंश में mRNAs का स्तर निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
वैकल्पिक रूप से, भारी polysomes (आमतौर पर 3 से अधिक राइबोसोम) युक्त भिन्न जमा कर रहे हैं और जीनोम चौड़ा polysome जुड़े mRNA स्तर माइक्रोएरे या गहरे अनुक्रमण का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं. यह polysome जुड़े mRNAs के स्तर साइटोसोलिक mRNAs का स्तर 21 कि प्रभावित ट्रांसक्रिप्शनल और बाद transcriptional तंत्र से प्रभावित, अनुवाद के अलावा, कर रहे हैं कि बल देने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. इसलिए, polysome जुड़े mRNA से जीनोम चौड़ा डेटा का उपयोग कर अनुवाद में मतभेद निर्धारित करने के लिए यह transla के अपस्ट्रीम हैं कि जीन की अभिव्यक्ति मार्ग में कदम से प्रभाव के लिए सही करने के लिए आवश्यक हैtion 21. इस तरह के एक सुधार करने के लिए, साइटोसोलिक आरएनए 21 निर्धारित कर रहे हैं प्रत्येक नमूने से polysome जुड़े शाही सेना और जीनोम चौड़ा स्थिर राज्य mRNA स्तर के साथ समानांतर में तैयार किया जाता है. वर्तमान में, "अनुवाद दक्षता" (ते) अंक तथाकथित (polysome जुड़े mRNA डेटा और साइटोसोलिक mRNA डेटा के बीच प्रवेश अनुपात यानी) अक्सर एक का अनुवाद दक्षता पर साइटोसोलिक mRNA स्तर में परिवर्तन के प्रभावों के लिए सही करने के लिए नियोजित कर रहे हैं mRNA 22 दिया. हालांकि, अंतर अनुवाद की पहचान करने के लिए ते स्कोर का उपयोग के कारण सामान्यतः के रूप में नकली सहसंबंध 27 में भेजा ते स्कोर का एक गणितीय संपत्ति के लिए झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी निष्कर्षों की पर्याप्त संख्या के साथ जुड़ा हुआ है. दरअसल कई प्रयोगशालाओं से डेटा सेट के एक सर्वेक्षण में इस तरह के नकली सहसंबंध translatomes 23 में परिवर्तन का विश्लेषण करते समय अपरिहार्य होने लगते हैं कि संकेत दिया. इस अंतर टीआर की "विश्लेषण के विकास के लिये कहा aforementioned कमियों 23 से ग्रस्त नहीं है जो anslation "(anota) एल्गोरिथ्म,. Anota विश्लेषण के दौरान एक प्रतिगमन मॉडल साइटोसोलिक शाही सेना के स्तर का स्वतंत्र translational गतिविधि के उपायों प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तरह के उपाय तो स्थितियां और एक आँकड़े गणना की है के बीच तुलना कर रहे हैं. उपयोगकर्ता सांख्यिकीय शक्ति में सुधार और कुछ replicates 24 के साथ पढ़ाई में झूठी सकारात्मक निष्कर्ष की घटना को कम कर देता है जो एक विचरण संकोचन पद्धति लागू करने का विकल्प है. गौरतलब है कि हाल ही में यह translatome में perturbations anota ने कब्जा कर लिया है कि प्रदर्शन किया गया, लेकिन ते नहीं स्कोर, proteome 25 में परिवर्तन के साथ सहसंबंधी. इसलिए, यह अत्यधिक एक जीनोम व्यापक पैमाने पर अनुवाद में परिवर्तन की पहचान के लिए anota विश्लेषण लागू करने की सिफारिश की है. Anota कलन विधि का सैद्धांतिक आधार पहले से 21,23,26 विस्तार से चर्चा कर रहे थे, यहाँ ध्यान अभ्यास में इसे लागू करने के बारे में है.
सेल में mRNA अनुवाद गतिविधि में परिवर्तन का अध्ययन करने के अलावा ve_content ">, इस राइबोसोम fractionation प्रोटोकॉल अलग और biochemically और कार्यात्मक राइबोसोम और polysome जुड़े प्रोटीन परिसरों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए अतीत में तैनात कर दिया गया है नए संश्लेषित polypeptides 27 और / या translational मशीनरी के घटकों की phosphorylation में शामिल कर रहे हैं की स्थिरता को विनियमित कि परिसरों. polysome विभाजन विधि का यह आवेदन भी संक्षेप में चर्चा की जाएगी.यह लेख स्तनधारी कोशिकाओं में एक जीनोम व्यापक पैमाने पर translational गतिविधि में गुणात्मक और मात्रात्मक परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए एक घर में विकसित विश्लेषण विधि के बाद अच्छी तरह से स्थापित polysome fractionation प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल विशेष ध्यान के सफल समापन 1) सेल confluency करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए के लिए प्रसार दर और पोषक तत्वों की उपलब्धता mRNA अनुवाद गतिविधि के साथ सहसंबंधी और translatome की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में (, सेल confluency) replicates और प्रयोगात्मक शर्तों में संगत होना चाहिए, 2) रैपिड सेल (cycloheximide और बफ़र्स में RNAse inhibitors की मौजूदगी के बावजूद, सेल तेज और सेलुलर अर्क तुरंत आरएनए गिरावट और polysomes की हदबंदी को रोकने के लिए सेल के बाद सुक्रोज ढ़ाल पर मढ़ा जाना चाहिए होना चाहिए), 3) ढाल तैयारी (सुनिश्चित करने के लिए उच्च डेटा reproducibility, सूक्रोज ढ़ाल ढाल निर्माता और विशेष उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए) उन्हें संभाल जब सामाजिक ध्यान रखा जाना चाहिए.
Translational गतिविधि में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों को अलग करने और उनके शारीरिक कार्यों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों ढाल भागों से immunoprecipitated और पश्चिमी सोख्ता या जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जबकि यह अंत करने के लिए, स्तर और विभिन्न राइबोसोम जुड़े प्रोटीन की phosphorylation स्थिति, टीसीए तेज़ी से निर्धारित किया जा सकता पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया. इस तकनीक की कमी धीमी ढाल अंश विधि जिसका बाध्यकारी कैनेटीक्स तेजी एसोसिएशन / हदबंदी में हैं भी कसकर बाध्य प्रोटीन की हदबंदी में परिणाम सकता है. नए संश्लेषित polypeptides तक जुड़े कारकों विशिष्ट उदाहरण हैं. राइबोसोम फार्म उभरते नए संश्लेषित polypeptides 3 जैसे रासायनिक पार linkers उपयोग कर राइबोसोम के साथ जुड़े प्रोटीन परिसरों पर स्थिर किया जा सकता है, 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. इस दृष्टिकोण से पता चला है कि सक्रिय सी Kinase 1 (RACK1) / C-Jun एन टर्मिनल kinase (JNK) / यूकेरियोटिक अनुवाद बढ़ाव कारक के लिए रिसेप्टर 1A2 (eEF1A2) जटिल 27 तनाव के जवाब में नए संश्लेषित polypeptides की गिरावट को नियंत्रित करता है. इसके अलावा, इसी तरह की कार्यप्रणाली प्रोटीन kinase सी Bii (PKCbII) यह नव संश्लेषित AKT polypeptides phosphorylates और नियंत्रित करता है जहां राइबोसोम पर होता RACK1 32 और mTOR जटिल 2 (mTORC2) की कि सक्रियण से राइबोसोम के लिए भर्ती किया गया है दिखा रहा है कि अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था उनके स्थिरता 33,34.
Anota विश्लेषण के बाद polysome विभाजन विधि का प्रमुख सीमाएं हैं: कक्षों की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या (~ 15 x 10 6 कोशिकाओं) के लिए 1) आवश्यकता, 2) एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम के स्थानीयकरण के बारे में स्थितीय जानकारी की कमी है, और 3 सेलुलर और आणविक असमलैंगिक से संबंधित मुद्दों)सामान्य और ट्यूमर ऊतकों की geneity. आवश्यक सेल नंबर से संबंधित मुद्दों जिसका मात्रा में उच्च बहुतायत कोशिकाओं से प्राप्त उन लोगों (जैसे HELA कोशिकाओं) 35 के साथ सीमित कर रहे हैं कोशिकाओं की monosomes (80) को इसी absorbance के स्पेक्ट्रा चोटियों aligning से सुलझाया जा सकता है. इस तरह मानव ऊतकों के रूप में जटिल प्रणालियों से प्राप्त जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की व्याख्या पर ऊतक विविधता के confounding प्रभाव से संबंधित मुद्दों पर चर्चा कर रहे हैं जबकि राइबोसोम की रूपरेखा तकनीक (नीचे देखें), एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम की सही स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लीक और मंजिला 36 द्वारा एक प्रकाशन में विस्तार से.
राइबोसोम संरक्षित टुकड़े (RPFs) RNAse मैं उपचार द्वारा उत्पन्न और गहरे अनुक्रमण 22 से विश्लेषण कर रहे हैं जिसमें हाल ही में, तकनीक रूपरेखा एक उपन्यास राइबोसोम, विकसित किया गया था. इस तकनीक है, जिससे अब तक unpr उपलब्ध कराने, एक एकल nucleotide संकल्प पर राइबोसोम स्थिति के निर्धारण की अनुमति देता हैराइबोसोम जीव विज्ञान में ecedented अंतर्दृष्टि. उदाहरण के लिए, राइबोसोम की रूपरेखा एक दिया mRNA अणु या तत्वों की पहचान पर राइबोसोम घनत्व के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के वैकल्पिक दीक्षा साइटों, गैर-Aug codons में दीक्षा और ऐसे uORFs रूप नियामक तत्व के रूप में प्रभाव अनुवाद दीक्षा दरों. हालांकि, सही mRNA अनुवाद दक्षता आकलन करने के लिए राइबोसोम की रूपरेखा की क्षमता सीमित है कि कई पद्धति सीमाएं हैं. ये यादृच्छिक विखंडन और RNase मैं पाचन द्वारा शुरू की स्वतंत्र पूर्वाग्रहों शामिल, अनुवाद संदमक (जैसे इमेटिन और cycloheximide उदाहरण के रूप में बढ़ाव inhibitors अनुवाद दीक्षा स्थलों पर राइबोसोम संचय के लिए प्रेरित करने की संभावना है) द्वारा शुरू की पूर्वाग्रहों, झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी परिणामों की एक बड़ी संख्या में जुड़े ते स्कोर के रूप में अच्छी तरह से भविष्यवाणी करने में उनकी अशुद्धि के साथ कि प्रोटीन कोडिंग mRNAs 37 से ही शुरू पढ़ता है. शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, जबकिराइबोसोम की रूपरेखा एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम स्थिति का प्रत्यक्ष पहचान देता है, एक दिया mRNA के साथ जुड़ा हुआ है कि राइबोसोम की संख्या परोक्ष रूप से कुल (बेतरतीब ढंग से खंडित mRNAs में मनाया उन पर RPFs (राइबोसोम जुड़े mRNA) में पढ़ता की आवृत्तियों सामान्य से अनुमान लगाया गया है mRNA). उदाहरण के लिए, चार "बी" mRNA अणुओं (बीए, बी बी, बी सी और बी) के पदों के लिए 1, 2, 3 और 4, राइबोसोम की रूपरेखा तकनीक का एक अंतर्निहित कमी पर चार राइबोसोम के कब्जे में हैं, जहां एक साधारण सेटिंग में अनुमति नहीं होगी एक सभी 4 राइबोसोम पदों 1 में बीए mRNA के साथ ही सहयोगी जहां परिदृश्य, 2, 3, और 4 और बा, बी बी, एबी और BD mRNA स्थिति 1, 2 पर एक भी राइबोसोम से प्रत्येक कब्जा कर रहे हैं, जहां एक परिदृश्य के बीच एक अंतर क्रमश: 3, और 4,. इसके विपरीत, polysome विभाजन के दौरान, polysome अखंडता जिससे राइबोसोम की एक निर्धारित संख्या (चित्रा 1) के साथ जुड़े mRNAs का ताल के अलगाव की अनुमति, संरक्षित है. यह आयातpolysome विभाजन और राइबोसोम की रूपरेखा के बीच चींटी भेद पूर्व विधि सीधे mRNP में mRNAs तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि प्रकाश और भारी polysome भिन्न, बाद विधि संभावना mRNAs की वजह से हैं कि translatome में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए असफल हो जायेगी कि पता चलता है कि संक्रमण से भारी polysomes को mRNP अंश से बदलाव है कि उन का योगदान overestimating, जबकि भारी polysomes को प्रकाश. aforementioned तरीकों के बीच इन विसंगतियों के जैविक महत्व ऐसे eIF4E के प्रति संवेदनशील हैं कि उन के रूप में mRNAs का एक सबसेट की कि translational सक्रियण दिखा डेटा की एक बड़ी शरीर से रेखांकित किया गया है, जैसे कि उन के रूप में दूसरों को शरण भारी polysomes को प्रकाश से संक्रमण, जबकि 5'TOP तत्वों, सीधे राइबोसोम मुक्त mRNA 6 के पूल से भारी polysomes को भर्ती कर रहे हैं. दिलचस्प है, mTOR मार्ग समन्वित रूप से "eIF4E के प्रति संवेदनशील" और 5'TOP mRNAs 1 का अनुवाद मिलाना दिखाया गया है1. इसलिए, ऊपर चर्चा कर रहे हैं कि methodological मतभेद translatome पर mTOR अवरोध के प्रभाव का आकलन करने के लिए 38,39 और polysome fractionation 24 रूपरेखा राइबोसोम का उपयोग पढ़ाई के बीच निष्कर्ष के स्पष्ट मतभेद समझा जा सकता है.
अंत में, polysome विभाजन और राइबोसोम की रूपरेखा मुख्य रूप से क्रमश: mRNA, पर mRNA और राइबोसोम की स्थिति के साथ जुड़े राइबोसोम की संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं कि पूरक तरीके हैं. महत्वपूर्ण बात है, इन तरीकों की कमियों और फायदे होते हुए भी, यह दोनों प्रक्रियाओं द्वारा प्राप्त जीनोम चौड़ा डेटा पर्याप्त रूप से विश्लेषण किया और कार्यात्मक और biochemically पुष्टि कर रहे हैं कि आवश्यक रहता है.
The authors have nothing to disclose.
इस शोध भी CIHR युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है जो आईटी के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान की कनाडा के संस्थानों (CIHR एमओपी 115,195) और FRQ-एस, द्वारा समर्थित किया गया था; और स्वीडिश अनुसंधान परिषद और स्वीडिश कैंसर सोसायटी राजभाषा
HEPES | Biobasic | HB0264 | |
MgCl 2 | Sigma | M8266 | |
KCl | VWR | CABDH4532 | |
Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
Tris | Biobasic | TB0196 | |
Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
Equipments | |||
SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
Buffers | |||
10X buffer for sucrose gradients: | |||
200 mM HEPES (pH7.6) | |||
1 M KCl | |||
50 mM MgCl2 | |||
100 µg/ml cycloheximide | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
100 units/ml RNase inhibitor | |||
Lysis buffer | |||
5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
2.5 mM MgCl2 | |||
1.5 mM KCl | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |