Her beskriver vi en tilpasning af protokoller, der anvendes til at fremkalde homøostatisk plasticitet i neuroner til studiet af plasticitet astrocytic G-protein-koblede receptorer. Senest anvendt til at undersøge ændringer i astrocytisk gruppe I mGluR'er med unge mus, kan anvendes den metode til at måle skalering af forskellige astrocytiske GPCRs, i væv fra voksne mus in situ og in vivo, og for at få en bedre forståelse af følsomheden af astrocytiske receptorer ændringer i neuronal aktivitet.
Tæt på to årtiers forskning har fastslået, at astrocytter in situ og in vivo udtrykker mange G-protein-koblede receptorer (GPCR), der kan blive stimuleret af neuron-frigivet transmitter. Imidlertid har evne astrocytiske receptorer at udstille plasticitet som reaktion på ændringer i neuronal aktivitet fået lidt opmærksomhed. Her beskriver vi en model, der kan bruges til globalt at skalere op eller ned astrocytisk gruppe I metabotrope glutamatreceptorer (mGluR'er) i akutte hjernesnit. Inkluderet er metoder til, hvordan man forbereder parasagittal hippocampusskiver, konstruere kamre er egnet til langsigtet skive inkubation bidirektionalt manipulere neuronal handling potentiale frekvens, load astrocytter og astrocyt processer med fluorescerende Ca 2 +-indikator, og måle ændringer i astrocytisk Gq GPCR aktivitet ved optagelse spontan og fremkaldte astrocyt Ca 2 + begivenheder ved hjælp af konfokal mikroskopi. I det væsentlige, en "calcium roadmap "er fastsat i, hvordan man måler plasticitet astrocytic GQ GPCRs. Anvendelser af teknik til undersøgelse af astrocytter diskuteres. Have en forståelse af, hvordan astrocytisk receptor signalering er påvirket af ændringer i neuronal aktivitet har stor betydning for både normal synaptisk funktion samt processer tilgrundliggende neurologiske lidelser og neurodegenerative sygdomme.
Astrocytter reagere inden for få sekunder til stimulering af neuroner eller neuronale axoner med stigninger i cytoplasmatisk Ca 2 + følge næsten udelukkende fra aktivering af astrocytic GQ GPCRs. For eksempel muskarine acetylcholinreceptorer 1, cannabinoidreceptorer 2, α 1A adrenerge receptorer 3, 4 og gruppe I-mGluR'er (se nedenfor), er alle astrocytic Gq GPCR undertyper, der akut reagerer på neuronal aktivitet. Aktivering af astrocytisk gruppe I-mGluR'er er blevet vist mest omfattende, efter stimulering af neuronale glutamaterge afferenter in situ (såsom akutte hippocampusskiver) 5-7, såvel som hos voksne mus cortex in vivo efter sensorisk stimulation 8. Resultatet af aktivering af astrocytisk Gq GPCR signalering på biologi og fysiologi astrocytter, neuroner, eller astrocyt-neuron interaktioner har været et spørgsmål om debat 9-12. Det vil være sogle tid, før funktionen af neuron-til-astrocyt-receptor signalering er fuldt forstået.
Mens det er klart, at neuroner kan aktivere astrocytiske receptorer ved hjælp af forsøgsprotokoller, der er aspekter af neuron-til-astrocyte receptor kommunikation, der fortsat er dårligt forstået. Først, den faktiske mængde neuronal aktivitet, der kræves for at aktivere astrocytisk Gq GPCRs ikke veldefineret, og for det andet har den evne astrocytiske receptorer at udstille brug afhængige plasticitet fået lidt opmærksomhed. Til at begynde at behandle disse spørgsmål, vi for nylig udviklet en protokol til at fremkalde tovejs skalering af astrocytisk gruppe I mGluR'er i akutte juvenil hippocampusskiver svar på langsigtede ændringer i neuronal handling potentiale (AP) er afhængige synaptisk aktivitet. Svarende til hvad der er blevet opdaget for tovejs homeostatiske plasticitet neuronale ionotrope glutamatreceptorer 13, 14, astrocytisk gruppe I-mGluR'er optrappe following blokade af neuronale virkningspotentialer og skalere ned, når neuronal handling potentiale frekvensen øges 15. Disse kan måles kompenserende ændringer i astrocytiske receptorer ved at optage spontane og fremkaldte astrocyt Ca 2 + transienter og sammenligne egenskaberne for disse begivenheder til dem fra astrocytter i kontrol forhold. I dette manuskript, beskriver vi den fuldstændige metode til brug af denne protokol, herunder udarbejdelse af akutte hippocampusskiver, inkubationsbetingelser at fremkalde astrocyte receptor skalering, astrocyte Ca 2 + indikator farvestof lastning, Ca 2 + billeddiagnostiske teknikker, der anvender konfokal mikroskopi, og de forventede virkninger på astrocyt Gq GPCR-aktivitet. Forudsigelige effekter på astrocyte Ca 2 + signalering egenskaber – der matcher dem, der tidligere er optaget i dyrkede celler transficeret med forskellige ekspressionsniveauer af GQ GPCRs – give en "køreplan", der kan bruges i fremtidige undersøgelser for at analysere for ændringer i såtrocytic GPCR udtryk. Forgreninger og potentielle anvendelsesmuligheder for brugen af denne teknik vil bidrage til vores forståelse af astrocyt-neuronale interaktioner i sunde og syge hjerne.
De beskrevne skalering modeller repræsenterer praktiske metoder til at forske langsigtede plasticitet astrocytisk gruppe I mGluR'er. Imaging spontane og fremkaldte Ca2 + hændelser tilvejebringer et følsomt assay til måling af ændringer i astrocytisk Gq GPCR-aktivitet, som er blevet etableret klare beviser, at astrocyt Ca 2 + stigninger forekommer efter frigivelse fra IP 3 R-sensitive butikker nedstrøms for Gq GPCR-aktivering 10, 12, 17, 18 år. Andelen af astrocytter i befolkningen reagerer på gruppe I mGluR-agonist og mønstret af sådanne Ca 2 + responser indberette ændringer i gruppe I mGluR'er af astrocytter.
Den specifikke teknik, der anvendes til at indlæse astrocytter med Ca 2 + indikator er en vigtig overvejelse i udformningen af eksperimenter til at kigge efter ændringer i astrocytisk Gq GPCR aktivitet. Bolus-loading eller bulk-loading flere astrocytter, eller patch-clamp loading enkelte astrocytter kan anvendes til at afbilde Ca 2 +-transienter i astrocytter. Hver tilgang giver visse fordele og ulemper. Direkte påfyldning astrocytter med Ca 2 + indikator via patch clamp tillader utvetydig identifikation af cellen som en astrocyt uden behov for en sekundær markør, såsom SR-101. Patch-clamp levering af indikator muliggør også optagelsen af Ca2 +-aktivitet fra små astrocytiske rum herunder busket fine processer, potentielt dybere i udsnit, hvor cellerne er sundere og med flere intakte interaktioner med synapser (afhængigt af lasereffekt findes). Men patch-clamp loading lider under lav overførselshastighed som data indsamles én celle ad gangen. Bulk-loading derimod giver et stort antal astrocytter til at blive lastet med Ca 2 + indikator og afbildes samtidigt. Men kun astrocytter nær overfladen (<20 um) af udsnittet er fyldt med tilhørende bekymrings om celle sundhed og intakte synapser.
Modtrykket bolus-loading-protokol, der præsenteres her giver en mellemvej med relativt høj kapacitet og mulighed for at overvåge Ca 2 + aktivitet dybere i den skive (40-75 um). En betydelig stigning i andelen af spontant aktive astrocytter ved hjælp af bolus-loading teknik er observeret i forhold til bulk-loading, hvilket tyder på, at de forbindelser mellem neuronale synapser og astrocytiske processer er mere komplet 15. Med god læsning, kan man ofte overvåge Ca 2 + aktivitet i de vigtigste processer i astrocytter (data ikke vist) eller potentielt endnu mindre rum ved hjælp af 2-foton mikroskopi. Imidlertid skulle, pleje skal udøves i at tildele de mindre processer til en bestemt astrocyte, da grænserne falde ind i uspecifik baggrundsfarvning. Et yderligere problem med brug af bulk-loading eller bolus-loading procedurer er behovet for en sekundær markedsker for astrocyte identifikation. Selv om det har været kendt i mange år, at astrocytter fortrinsvis tage op AM ester Ca 2 + indikatorer, er det sekundære markør SR-101 bruges ofte til at kontrollere de indlæste celler som astrocytter. SR-101 kan i sig selv ændre den iboende ophidselse af neuroner 29. Brug af SR-101 bestyrker behovet for at udføre alle astrocyt Ca 2 + målinger i TTX at begrænse eventuelle SR-101 effekter på neuronal uro. Antages det, at både kontrol og eksperimentelle grupper omfatter SR-101, skal markøren i sig selv ikke højde for de observerede virkninger i astrocyte Ca 2 + signalering efter langvarig manipulation af neuronale virkningspotentialer. SR-101 kan dog være mere af en bekymring i høj K + eksperimenter, da det kan reducere forskellen mellem 2,5 mM K + vs 5,0 mM K +, hvis den basale skudhastighed ikke ændres proportionalt.
En meget lovende tilgang til at levere Ca 2 + </sup> Indikator til astrocytter er opstået for nylig, som tilbyder et attraktivt alternativ til de mere traditionelle metoder ved hjælp af Ca 2 + farvestoffer. Betydelige fremskridt er sket i løbet af de sidste par år med genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) målrettet til astrocytter 30-32. GECIs kan leveres til astrocytter ved in vivo mikroinjektion af adenoassocierede virale vektorer i et område af hjernen af interesse, såsom hippocampus. Ekspression af GECIs opnås efter cirka to uger efter virusinfektion 32. Der er mange fordele præsenteres ved anvendelse af GECIs i astrocytter. Først bliver vektorer målrettet til astrocytter ved hjælp af en astrocyt-specifikke promotor, så de mærkede celler er astrocytter 32. For det andet signal-støj forekommer nu sammenlignes med, hvad der kan opnås ved anvendelse af patch-clamp levering af farvestof, men uden invasiv have haft en patch-pipetten på cellen 32. For det tredje kan indikatorerne være delivered og udtrykt i voksent væv, hvilket er problematisk at bruge løs-loading levering metoder. Desuden udtrykket er mosaik, giver mulighed for at skelne mellem flere astrocytter. Således kan flere astrocytter potentielt afbildet samtidig, men også optager i soma og fine branchlets samtidig. Derfor kunne potentielt en enkelt teknik kan anvendes i stedet for tre adskilte teknikker (løs-loading, bolus-loading, og patch-clamp belastning) for at optage skalering aktivitet astrocytic GQ GPCRs, i høj grad øge effektiviteten.
En potentiel ulempe ved at bruge viral-medieret levering af Ca 2 + indikatorer til astrocytter er den mulige indvirkning på skive sundhed 32.. Den adenoassocierede virale vektorer, der anvendes til at levere de GECIs er tidligere blevet vist at forårsage reaktiv gliose af astrocytter 33. Udarbejdelse af hjernen skiver i almindelighed sandsynligvis indleder tidlige stadier af patologi, herunder frigivelse af inflammatory molekyler 10. Derfor, kombineret med de lange inkubationstider kræves for at fremkalde skalering af astrocytiske receptorer, brug af GECIs leveres ved hjælp af virale vektorer vil være nødvendigt at modtage yderligere vederlag i forbindelse med skive sundhed i disse typer af eksperimenter.
Ved anvendelse af denne protokol, er det vigtigt at huske på, at ansøgningen tid for agonist til at producere et svar vil variere som en funktion af receptor tilgængelighed. For en given koncentration af agonist, vil ansøgningen tid nødt til at være længere, hvis receptorer er skaleret ned, og kortere, hvis receptorer er skaleret op, for lægemidlet til at nå frem til en passende koncentration i vævet til at aktivere receptorer i tilstrækkelig grad til at producere en Ca 2 + respons. Derfor kan lægemidlet påføringstider, og potentielt deres koncentration, skal justeres afhængigt af den tilsigtede retning af skalering. For eksempel kan agonistkoncentrationen skal sænkes i Case af TTX at undgå at mætte reaktioner og øget efter inkubation skiver i høj K + til endda se en reaktion. Konkret blev DHPG koncentration flyttet 5-15 pM efter TTX behandling til 30-50 uM efter 5,0 mM K + behandling for at studere Ca 2 + reaktionsmønstre, som 5-15 uM ofte var for lav til at producere pålidelige reaktioner i astrocytter efter aftrapning af gruppe I mGluR'er.
Registrering af astrocyt Ca 2 + aktivitet giver ingen direkte beviser for receptor indsættelse eller internalisering til eller fra plasmamembranen. Men baseret på den bemærkelsesværdige lighed af data med data fra tidligere undersøgelser in vitro, der undersøgte det direkte forhold mellem Gq GPCR udtryk niveauer og spontane og fremkaldte Ca 2 + transienter 21-24, den mest logiske fortolkning af de ændringer i Ca 2 + signalering er at astrocyt overflade receptor ekspressionsniveauer harændret. En supplerende strategi kan være en vigtig overvejelse, hvis man ønsker at give yderligere beviser på locus af effekten på Ca 2 + aktivitet. En strategi, vi brugte, var at undersøge effekten af TTX inkubation på hippocampusskiver fra astrocytic MrgA1R mus. Disse transgene mus udtrykker en udenlandsk Gq GPCR (den MrgA1R) kun i astrocytter. Fordi denne receptor ikke er nativ til hjernen, er der ingen endogen neurotransmitter til stede til at ændre sine aktivitetsniveau. Tidligere arbejde antydede, at denne receptor i indgreb med den samme intracellulære signalmolekyler såsom endogen gruppe I-mGluR'er i de samme astrocytter 34. Efter langvarig inkubation af skiver fra MrgA1R mus i TTX, ingen forskelle i agonist-fremkaldte MrgA1R respons sammenlignet med kuldsøster kontrol inkuberes skiver ville give dokumentation for, at effekten på astrocyte Ca 2 + aktivitet skyldes ændringer lokaliseret til overfladen receptor, især hvis gruppe I mGIuR svar er stadig betydeligt forbedret i de samme astrocytter. En alternativ, men måske mere involveret strategi ville være at isolere astrocytter fra udsnit til Western blot-analyse, så længe en membranfraktion kunne analyseres for ændringer i overfladen receptor ekspressionsniveauer. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) eller flowcytometri kan være nyttige her.
De mulige anvendelser af denne teknik til studiet af neuroner, astrocytter og astrocyt-neuronale interaktioner er mange. I vores eksperimenter, kun DHPG-fremkaldte gruppe I mGIuR astrocytic Ca 2 + responser blev undersøgt, i isolerede akutte hippocampusskiver fra unge mus. Dette præparat ikke kun har de intakte afferenter (Schaffer sikkerhedsstillelsen), men også de neuroner, der giver anledning til dem (CA3 pyramideformede celler), som gør det muligt at manipulere fyring satser af disse glutamaterge neuroner på de postsynaptiske celler (CA1 pyramideformede celler) og astrocytterne i stratum radiatum hvis processer er forbune med disse synapser. Den akutte hippocampus skive kan ikke være den bedste forberedelse til at manipulere fyring satser af andre typer af neuroner, er imidlertid så mange afferenter udsondres fra de neuroner, der giver anledning til dem. Ikke desto mindre kan det være muligt i visse slice præparater at observere plasticitet andre astrocytic Gq GPCR undertyper. For eksempel kan skiver fremstilles med basale cholinerge forhjerneneuroner og deres projektioner til Hippocampus intakt. Inkubation af disse skiver i TTX eller forhøjet K + vil påvirke basal fyring satser af cholinerge neuroner, hvilket fører til skalering af mAchRs i astrocytter fra stratum Oriens, som modtager en betydelig del af den cholinerge indgang 1. En alternativ endnu uprøvet tilgang til at studere astrocytisk receptor skalering inden for et bestemt område af hjernen, med alle de forbindelser intakte mens skalering sker, kunne være at anvende en in vivo-model, hvor en vedvarende frigivelse af TTX opnås ved implantation af en plastic polymer Elvax 40W over området af interesse 35. Denne fremgangsmåde har været anvendt tidligere i en undersøgelse af neuronal skalering, men bør også gælde for astrocytisk skalering. Endelig med den rette udlæsning, kan fremtidige studier undersøge andre GPCR familier, herunder ændringer i G s eller g I GPCRs. Man kunne forudsige astrocytisk GABA B Gi GPCRs at blive påvirket efter hæmning af fyring i lokalt fremspringende GABA interneuroner inden for en skive forberedelse. Udvikling af nye indikatorer rettet mod andre signalmolekyler, såsom en real-time indikator for anden messenger cAMP, ville åbne op for et helt nyt forskningsområde på neuron-til-astrocyt receptor kommunikation.
Tovejs skalering af astrocytiske mGluR'er ved manipulation af basale neuron fyring satser giver et mål for følsomheden af astrocytter til AP-medieret frigivelse af neurotransmitter. Astrocytter kan tilsyneladende fornemme spontane ApS og glutamate frigivelse Schaffer sikkerhedsstillelse-CA1 pyramideformet celle synapser, selv når ekstracellulær K + er inden for et fysiologisk område. Mens akut anvendelse af TTX ikke reducerer hyppigheden af spontane astrocyte Ca 2 + aktivitet 18, 36, 37, Ca 2 + aktivitet blandt astrocytter i befolkningen bliver decorrelated 36, som godtgør, astrocytiske receptorer er AP detektorer. Dette antyder, at astrocytter fornemmer spontane neuronale ApS med ingen indflydelse på deres samlede Ca 2 + aktivitet. Det er almindeligt accepteret, at intracellulære koncentrationer af IP 3 brug for at nå en tærskelværdi for at stimulere IP 3 R'er tilstrækkeligt til at føre til en påviselig Ca 2 + elevation. Kunne spontane neuronale APs aktivere astrocytiske GPCRs uden at producere målbare Ca 2 + stigninger? Fremtidige studier kunne benytte Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) eller en lignende techn ique (såsom BRET) for at undersøge forholdet mellem G-protein kobling til receptoren (et mål for receptor-aktivering), og Ca 2 + frigivelse fra interne butikker. BRET har været anvendt i udstrakt grad in vitro til påvisning af G-protein-til-GPCR kobling 38, selv om det kan være en vis tid, før denne teknologi bliver tilgængelig til brug i intakte vævspræparater. Det er muligt, astrocytic GQ GPCRs bliver aktiveret langt hyppigere, end der kan optages ved hjælp af de tilgængelige Ca 2 + billeddiagnostiske værktøjer. Ud over at sensing virkningspotentialer kan astrocytic GQ GPCRs også være i stand til at opdage miniature kvantemekaniske frigivelse af neurotransmitter som rapporteret i en nylig undersøgelse 39. Det tovejs skalering her beskrevne metode kan anvendes i fremtidige undersøgelser for at give et mål for, i hvilket omfang astrocytisk GQ GPCRs opdage kvantalt vesikulær frigivelse af neurotransmitter, ved at inkludere bafilomycin A1 i inkubationstiden protokollen.
ntent "> Hidtil skalering protokoller er kun blevet anvendt i hippocampusskiver fra unge mus (P12-P18). Derfor er det på nuværende tidspunkt ukendt, hvis astrocytisk receptor skalering også kunne fremkaldes i væv fremstillet af voksne mus. En overbevisende nylig undersøgelse tyder på, at gruppe I mGluR udtryk i astrocytter mindskes betydeligt efter den første uge af alder og fortsætter med at falde indtil voksenalderen, med meget lave niveauer af receptor-ekspression i voksne astrocytter 40. Det ville derfor være interessant at afgøre, om astrocytiske mGluR'er skalere op efter lang sigt hæmning af neuronfyring hos voksne mus hippocampus skiver til et niveau, der nærmer sig dem, der ses i astrocytter fra unge mus. Dette fund tyder på, at astrocytisk receptor udtryk er ikke statisk ved en given alder, men kan hurtigt ændre sig afhængigt af niveauet af neuronal aktivitet. I modsætning til reduceret ekspression af gruppe I mGluR'er i voksne mus, der beviser, at opstå, at adrenerge receptorer, herunder & #945, 1A, α 2A, og β 1-subtyper, overvejende udtrykt af astrocytter i den voksne hjerne 3, 4. Den α 1A adrenerge Gq GPCR kan være et attraktivt mål for fremtidige undersøgelser af neuron-til-astrocyte kommunikation, herunder om disse receptorer er følsomme over for ændringer i adrenerge neuron fyring satser.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende UC Riverside Center for Glial-neuronale interaktioner for værdifuld diskussion af skalering protokoller og data. Forfatterne vil også gerne give en oprigtig tak til Abcam for at sponsorere udgivelsen af deres arbejde.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |