יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי
Summary
טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלים מהונדסים.
Abstract
הצורך בתרבויות osteocyte ידוע לקהילת חוקרי עצם; בידוד של osteocytes העיקרי הוא קשה ומייצר מספרי תא נמוכים. לכן, המערכת הסלולרית הנפוצה ביותר היא שורת התאים כמו osteocyte-MLO-Y4.
השיטה שתוארה כאן מתייחסת לשימוש של חומצה רטינואית ליצירת אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים עם תכונות osteocyte מורפולוגיים ומולקולריים.
לאחר הבידוד של osteoblasts ממכסה גולגולת עכבר, חומצה רטינואית כל טרנס (ATRA) הוא הוסיף למדיום סלולרי, ותא ניטור מתבצע מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. שינויים מורפולוגיים הראשונים הם לגילוי לאחר 2 ימי טיפול והבידול הוא בדרך כלל מלא ב5 ימים, עם התפתחות הדרגתית של דנדריטים, אובדן היכולת לייצר מטריצה תאית, למטה רגולציה של סמני תא עצם ועד הוויסות של מולקולות osteocyte ספציפי.
תוכן "> יש צורך בניטור תא היומי בגלל ההשתנות הפנימית של תאים ראשוניים, והפרוטוקול יכול להיות מותאם עם וריאציה מינימאלית לתאים המתקבלים מזנים שונים עכבר וליישם מודלים מהונדסים.השיטה היא קלה לביצוע ואינו דורשת מכשור מיוחד, היא לשעתקו מאוד, ומהירות יוצרת אוכלוסיית osteocyte בוגרת בהיעדר המטריצה תאית מלא, המאפשרת שימוש בתאים אלה ליישומים ביולוגיים בלתי מוגבלים.
Introduction
Osteocytes, סוג תא עצם הנפוץ ביותר, הוא הבדיל סופני, תאים מסועפים מאוד עמוק הנמצאים בתוך השלד. גוף התא של osteocytes הבוגר כלולים בחסר עצם ויש צורות מגוונות; osteocytes עם גופי תא מוארכים נמצא בקליפת מוח העצם, ואילו osteocytes המעוגל הם תכופים יותר בעצמות הטרבקולות 1. דנדריטים מסועפים להאריך מגוף התא ומתגוררים בערוצים זעירים המכונים נקבות, ויוצרים רשת סבוכה שגורמת לאנשי קשר מרובים לא רק עם osteocytes אחר, אלא גם עם סוגים אחרים של תאי עצם, מח עצם, כלי דם וpericytes הכרוך בכך. באמצעות נוזל ביניים הכלולים בקונות ונקבות, osteocytes גם סופו של דבר מחובר למערכת במחזור, ולכן הם יכולים להשפיע לא רק מקומיים, אלא גם אירועים מערכתיים, ולהיפך ההתנהגות שלהם יכולה להיות מוסדרת על ידי שני שינויים מערכתיים והמקומיים 2.
מחקר של osteocytes לאחרונה צבר תאוצה, הודות לכמה חידושים טכנולוגיים, כגון הדור של רקמות ובעלי חיים מהונדסים תא ספציפי, השימוש בשיטות מיקרוסקופיה רבות עוצמה ושל הקרנה מולקולרית תפוקה גבוהה 3,4. עם זאת, ידע של תאים אלה עדיין לא הושלם, בעיקר בשל מיעוט היחסי של דגמים מתאימים במבחנה. למעשה, osteocytes היה תמיד קשה להשיג ולשמור על בתרבות בגלל המיקום העמוק, והרמה הנמוכה של ריבוי המאפיין את סוג תא מובחן כזה.
לאורך השנים, במספר השיטות פותחו כדי לבודד osteocytes העיקרי 5-7, למרות שהם בדרך כלל לייצר תשואות תא נמוכות ולשאת את הסיכון שאפילו כמה fibroblasts זיהום יהיה במהירות לגדול osteocytes 8. מסיבה זו, רוב ניסיוני בעבודה חוץ גופית כבר נערך עד כה על ליטר תא osteocyte המבוסס היטבine MLO-Y4 9.
במבחנה מתודולוגיות נוספות יכולה לשפר את האפשרות ללמוד את התאים האלה ויכולות לשפר את הניתוח של הביולוגיה osteocyte והפתופיזיולוגיה. להיות במידה רבה אימצו, שיטות כאלה צריכה להיות קלים לשחזר, ולא דורשות מכשור מיוחד או פעמים רבות מאוד כדי להגיע להבשלת תא. חשוב לציין, אם רלוונטי לתאים ראשוניים, הם היו מאפשרים לנצל בעלי חיים מהונדסים. לאחרונה תוארו כי טיפול של הקו הסלולרי osteoblast MC3T3-E1 ושל osteoblasts העיקרי עם חומצה הרטינואית גורם לשינוי פנוטיפ מהיר שמוביל להתפתחות של אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes 10.
כל טרנס החומצה רטינואית (ATRA) היא מוצר מטבולים פעיל של ויטמין A המסדיר שעתוק הגנים על ידי קשירה לקולטנים החומצה הרטינואית הגרעיניים (Rars). Rarsנקשרים ל-DNA כheterodimers עם קולטנים X retinoid (RXRs), סופו של דבר מוביל לאפנון של חומצה רטינואית (RA) מגיב לגני המטרה 11. ATRA הוכח לווסת את התמיינות והתבגרות של כמה סוגי תאים, ובהם תאים מסועפים אחרים, כגון תאים עצביים 12 וpodocytes 13.
השיטה שתוארה כאן מתבססת על תוספת של ATRA לosteoblasts העיקרי. כדי להיות יעיל, ATRA יש להוסיף בשלב הבשלה מדויק על תאים מצופים בצפיפות מוגדרת; בניסיון שלנו בתנאים אלה הם קריטיים כדי להשיג את מתג פנוטיפ מosteoblasts לosteocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנים האחרונות osteocyte התפתחה כתא המרכזי ביותר בעצמות. התקדמות במחקר בהדרגה מגלה מספר מאפייני osteocyte בלתי צפויים או בלתי מוכחים בעבר, שהם בעלי ערך עצום לעיצוב חדשני וטיפול טוב יותר עבור מגוון רחב של מחלות עצם. עם זאת, חקירה של הביולוגיה osteocyte כבר סובלת מהזמינות המוגבלת של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון ניתן על ידי "Progetto Fondazione IRCCS Ospedale מאג'ורה Policlinico concorso 2009-2010" לMD, וAssociazione מבין Nefropatico ABN Onlus, מילאנו
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte–a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 .
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 .
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , (2010).
- Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
