Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग जैविक नमूनों की इमेजिंग लाइव नमूनों की सुपर संकल्प की अनुमति प्रकाश के विवर्तन के संकल्प बाधा को दूर करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों के साथ काफी उन्नत है. प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED), (जैसे कि पाम, तूफान, और GDSIM रूप तकनीकों सहित) एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) – सुपर संकल्प तकनीक के तीन मुख्य प्रकार वर्तमान में कर रहे हैं. STED और एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक संकल्प में सबसे बड़ा बढ़ जाती प्रदर्शित करते हैं, वे छवि अधिग्रहण की वृद्धि की गति की पेशकश करने के लिए धीमी गति से किया गया है. तीन आयामी सिम (3 डी सिम) एकल अणु स्थानीयकरण और STED दोनों अधिक लाभ का एक नंबर प्रदान करता है कि एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक है. संकल्प के लिए अनुमति देता है, coverslip से ठेठ पार्श्व और अक्षीय 110 के प्रस्तावों और 280 एनएम, क्रमशः और ऊपर से 30 माइक्रोन के नमूने की गहराई के साथ सुधार हुआ है,पूरे कोशिकाओं की इमेजिंग. काफी फोटो विषाक्तता और photobleaching को कम करते हुए कच्चे छवियों का कब्जा दर में वृद्धि प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल की प्रगति (तेजी से 3 डी सिम), सेकंड में होने वाली जैविक प्रक्रियाओं के तेजी से कब्जा करने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम छवि के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं दिखाने के लिए कैसे fluorescently लेबल cytokinetic FtsZ प्रोटीन और इस तकनीक प्रदान कर सकते हैं कि अद्वितीय जानकारी के प्रकार को शरण देने बैक्टीरियल कोशिकाओं एक ऐसी विधि के प्रयोग का वर्णन है.
विभिन्न इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के एक नंबर विभिन्न इलेक्ट्रॉन और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक सहित बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए साल भर में इस्तेमाल किया गया है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अत्यंत उच्च संकल्प प्रदान करता है whilst, नैनोमीटर के लिए नीचे, एक निर्वात और विपरीत एजेंटों के उपयोग के लिए की जरूरत तय की और एम्बेडेड नमूनों के लिए इस तकनीक सीमित है. कलाकृतियों की वजह से भी लंबा नमूना तैयार करने और एक कुशल चिकित्सक के नमूने तैयार करने के लिए, और जिसके परिणामस्वरूप छवियों का विश्लेषण और व्याख्या की जरूरत है के लिए पेश किया जा सकता है. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सरल नमूना तैयार करने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में अपेक्षाकृत आसानी से एकाधिक लेबल के आवेदन का लाभ प्रदान करता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन और डाई conjugates, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जीवित कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता का उपयोग करना भी संभव है. कैमरा का पता लगाने techn में सेल विषाक्तता, साथ ही अग्रिमों की कमी हुई करने के लिए अग्रणी फ्लोरोफोरे स्थिरता और फ्लोरोसेंट प्रोटीन आकार / संरचना में सुधार के साथology, व्यापक क्षेत्र और confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी काफी कोशिकाओं के स्थानिक गतिशीलता के बारे में हमारी समझ को विस्तार किया गया है. इन तकनीकों का प्रयोग, पिछले 20 वर्षों में बैक्टीरिया कोशिका के हमारे ज्ञान बैक्टीरिया कोशिका 1 भीतर संरचनात्मक और प्रोटीन संगठन के एक उच्च स्तर का पता चलता है कि एक कहीं अधिक विस्तृत विवरण के लिए काफी प्रगति की है.
हालांकि, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के परंपरागत तरीकों निहित संकल्प इस्तेमाल किया उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के आधे के बारे में है जिसका अर्थ है कि विवर्तन सीमित हैं. नतीजतन, यहां तक कि सबसे इष्टतम पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली के साथ, सबसे अच्छा पार्श्व संकल्प के बारे में 220-250 एनएम और अक्षीय संकल्प के बारे में 500 एनएम है (समीक्षा के लिए Schermelleh एट अल. 2 देखें). विशेष रूप से बैक्टीरिया कोशिका जीव के लिए, यह अभी भी गंभीर रूप से इन छोटे कोशिकाओं के स्थानिक संगठन के बारे में हमारी समझ की सीमा; diam में केवल 1-2 माइक्रोन जा रहा हैeter और लंबाई में 1-10 माइक्रोन. एक प्रोटीन के गतिशील स्थानिक व्यवहार विट्रो डेटा में पूरक करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, जहां जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता है कि उच्च संकल्प तकनीक की जरूरत भी नहीं है.
पिछले दशक के दौरान, कई सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक विकसित किया गया है. सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्य कम से कम दोगुना पार्श्व संकल्प, जिससे विवर्तन बाधा पर काबू पाने कि इमेजिंग तकनीकों का वर्णन है. इन तकनीकों में स्पष्ट संकल्प में असली बढ़ जाती है बनाने के लिए उत्सर्जित प्रकाश की रोशनी और / या विश्लेषण में हेरफेर. सुपर संकल्प तकनीक के तीन मुख्य प्रकार वर्तमान में कर रहे हैं – मैं) उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी 3 (STED) प्रेरित; ऐसे photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी 4,5 (पाम), stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी के रूप में तकनीक सहित द्वितीय) एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, <sव्यक्तिगत अणु वापसी 8 (GDSIM) के साथ> 6 (तूफान), प्रत्यक्ष तूफान 7 (dSTORM), और जमीन राज्य कमी; और iii) संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 9-12 (सिम). एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक जैविक नमूने में नीचे एनएम 10-40 के बीच करने के लिए, पार्श्व संकल्प में सबसे बड़ा बढ़ जाती है प्रदान करते हैं. एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के कई कार्यान्वयन में, नमूने की गहराई क्षणभंगुर लहर तक ही सीमित है और STED की प्रारंभिक कार्यान्वयन भी नमूना गहराई में सीमित थे. अक्षीय दोनों में हालांकि, इस तरह अनुकूली प्रकाशिकी के उपयोग के रूप में हाल ही में प्रगति, विभिन्न फोकल प्वाइंट में बात फैल समारोह में दृष्टिवैषम्य के शोषण, बहु विमान का पता लगाने और उत्सर्जित प्रकाश का अक्षीय स्थिति अनुमान को दो उद्देश्यों का उपयोग देखा है सुधार STED और एक अणु स्थानीयकरण 13,14 दोनों में संकल्प और नमूना गहराई. STED के लिए डाटा अधिग्रहण दरों और एकल अणु स्थानीयकरण तकनीककारण (स्थानीयकरण तकनीक के लिए ऊपर 50,000) अधिकतम संकल्प के लिए अधिग्रहीत की जाने की जरूरत है कि छवियों की बड़ी संख्या को भी अपेक्षाकृत धीमी गति से कर रहे हैं. यह धीमी गति से डाटा अधिग्रहण अक्सर काफी महंगे हैं कि कस्टम संशोधनों के बिना जीना नमूनों की इमेजिंग के लिए उधार नहीं करता है. इन दोनों तकनीकों वर्तमान में बेहतर (समीक्षा के लिए 2,15 देखें) तय नमूने के लिए अनुकूल हैं, हालांकि, बहुत काम इस सीमा को संबोधित करने के लिए किया जा रहा है.
तीन आयामी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी सिम) लगभग 110 और 280 एनएम, क्रमशः के प्रस्तावों में जिसके परिणामस्वरूप दोनों पार्श्व और अक्षीय संकल्प को बेहतर बनाता है कि एक व्यापक क्षेत्र तकनीक है. नमूने की गहराई पूरे कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, coverslip से 30 माइक्रोन तक है. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप प्रयोगात्मक (OMX) मंच पर Sedat, Agard, और Gustaffsson द्वारा विकसित 3D-सिम की भिन्नता अलग 15 में ले जाया जाता है जो एक ज्ञात ग्रिड पैटर्न के साथ नमूना रोशन शामिलप्रत्येक Z विमान 9-11 में पदों. नमूदार क्षेत्र से बाहर आवृत्ति अंतरिक्ष में बनाया जाता है जिसके परिणामस्वरूप मौआ पैटर्न में किनारे मापा जाता है. आवृत्ति अंतरिक्ष से जानकारी एक दृश्य सुपर संकल्प छवि 10,11 उत्पन्न करने के लिए computationally खंगाला है. कच्चे छवियों इस तकनीक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जिस पर सापेक्ष गति जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. हालांकि, यह सेकंड के एक समय पैमाने पर होने वाली जैविक प्रक्रियाओं के लिए, कच्चे छवियों के अधिग्रहण की दर अभी भी गतिशील परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए बहुत धीमी है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. सेकंड के एक कब्जा दर के साथ समय श्रृंखला के लिए, पर्याप्त वसूली समय बिना दोहराया अधिग्रहण विशेष रूप से छोटे जीवाणु कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग के दौरान, phototoxicity और photobleaching के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इन समस्याओं को दूर करने के लिए, तेजी से 3 डी सिम (f3D सिम) के लिए हाल ही में प्रगति विकसित किया गया है. यहाँ हम मैं था कि OMX ब्लेज़ 16 के रूप में जाना एक वर्णनयह तकनीक पहले सिस्टम में इस्तेमाल किया गया था के रूप में एक भौतिक ग्रिड के उपयोग के बिना नमूनों रोशनी देर से 2011 में बनाता ntroduced. प्रकाश मुस्कराते हुए और नए शटर प्रौद्योगिकी हस्तक्षेप के उपयोग के एक बहुत तेजी से फैशन में नमूना पर नमूनों प्रकाश के निर्माण के लिए अनुमति देता है. मौजूदा EMCCD कैमरों की तुलना में जब छवि अधिग्रहण की गति आगे विशेष रूप से, वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (sCMOS) कैमरों की शुरूआत के साथ बढ़ाया गया था. ये परिवर्तन सेकंड 16 के भीतर होते हैं कि कोशिकाओं के भीतर गतिशील परिवर्तन की निगरानी की अनुमति, 1 माइक्रोन (512 x 512 पिक्सल, 9 Z-स्लाइस) का एक नमूना गहराई के लिए प्रति सेकंड एक फ्रेम के एक संभव छवि अधिग्रहण की दर में हुई. स्पष्ट जोखिम (उत्तेजना) के समय में कमी विस्तारित समय श्रृंखला पर कब्जा कर लिया जा करने की अनुमति देता है या तो इस विधि या कब्जा दर में वृद्धि का उपयोग कोशिकाओं रहते हैं.
यहाँ हम examin को f3D सिम माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णनई संरचना और दो बैक्टीरियल प्रजातियों की कोशिकाओं में cytokinetic जेड अंगूठी की गतिशील आंदोलन: छड़ी के आकार का मॉडल जीव बेसिलस subtilis और coccoid मानव रोगज़नक़ Staphylococcus aureus. FtsZ बैक्टीरिया 17,18 में कोशिका विभाजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक ट्यूबिलिन तरह cytoskeletal प्रोटीन है. यह विभाजन तंत्र 17,18 बनाने, कम से कम 20 अन्य विभाजन प्रोटीन की भर्ती के लिए विभाजन साइट के लिए localizes, और सेल कसना 19-23 के लिए बल प्रदान करने के लिए माना जाता है. इस विधि FtsZ विभिन्नतापूर्वक एक मनका की तरह व्यवस्था में दोनों जीवों में जेड अंगूठी के आसपास वितरित किया जाता है कि पता चलता है; इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी (ईसीटी) 24 ने सुझाव दिया है के रूप में पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या एक टूटनेवाला संरचना द्वारा कल्पना के रूप में जेड अंगूठी, सेल के चारों ओर एक निरंतर वर्दी बेल्ट है कि क्या लंबे समय से आयोजित इस मुद्दे को सुलझाने. हम 3 डी सिम की क्षमता बेहद छोटे के स्थानिक परीक्षा (1 कैसे सुधार सकते हैं दिखानेमाइक्रोन व्यास) एस की तरह गोल कोशिकाओं लगातार तीन सीधा विमानों (एक्स, वाई, जेड) में विभाजित है कि ऑरियस. इन तकनीकों का उपयोग करते समय चूक पढ़ाई जेड अंगूठी की संरचना में और एक निश्चित पाड़ 24 से बाहर जाने सकल रिंग के भीतर संगठन परिवर्तन, बजाय FtsZ अणुओं के साथ, गतिशील है कि दिखा.
फ्लोरोसेंट जीना सेल इमेजिंग समय के साथ कोशिकाओं के भीतर गतिशील परिवर्तन के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. बैक्टीरिया कोशिका जीव विज्ञान के लाइव इमेजिंग क्योंकि छोटे सेल आकार का चुनौतीपूर्ण हो गया और उत्तेजना प्रकाश को दोहराया जोखिम झेलने में बैक्टीरियल कोशिकाओं की क्षमता कम हो गया है. f3D सिम सभी कोशिका जीव विज्ञान से पूछताछ करने के लिए उपलब्ध उपकरणों का विस्तार किया गया है, लेकिन यह खराब कार्यान्वित अगर कलाकृतियों को पेश किया जा सकता है के रूप में ध्यान से इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. इस तकनीक के सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कारणों में से एक नंबर रहे हैं. यह सही छवि पुनर्निर्माण सक्षम करने से परहेज किया जाना चाहिए उत्सर्जित प्रकाश, अपवर्तनांक बेमेल और उत्सर्जित प्रकाश का गोलाकार विपथन की बात फैल समारोह के उपयोग पर निर्भर करता है कि एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधि है. एक उच्च गुणवत्ता के 0.17 मिमी मोटाई की coverslips के उपयोग के कारण कवर में कांच मोटाई परिवर्तनशीलता के संकेत तीव्रता के परिवर्तन से बचने के लिएहोंठ अत्यधिक की सिफारिश की है. यह ध्यान से सभी प्रयोगों के प्रारंभिक चरणों के दौरान उत्सर्जित प्रकाश का गोलाकार विपथन का मूल्यांकन करने और जरूरत के रूप में विसर्जन तेल अपवर्तनांक समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह तापमान और नमूना के बढ़ते मीडिया / सब्सट्रेट दोनों पर निर्भर है के रूप में इस दिन को दिन से भिन्न हो सकते हैं. गलत तेल का उपयोग ऐसे halos और गूंज संकेत के रूप में कलाकृतियों के साथ छवियों के अवर पुनर्निर्माण में परिणाम होगा.
छवि पुनर्निर्माण प्रक्रिया के अंत में, प्रत्येक चरण के लिए पुनर्निर्माण की गुणवत्ता का एक उपाय रोशनी के प्रत्येक चरण / कोण के लिए "ko कोण के लिए सबसे अच्छा फिट" के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस मूल्य प्रत्येक कोण के लिए 1 से कम है, तो खंगाला की गुणवत्ता शायद सबसे अधिक हो जाएगा. इस मूल्य 6 से ऊपर है, तो यह खंगाला छवि कलाकृतियों में शामिल होंगे कि सबसे अधिक संभावना है. आम कलाकृतियों मैं) संगत छवि में धारियों की उपस्थिति में शामिलग्रिड के कोण से एक है. यह है कि ग्रिड कोण से कम संकेत से हो सकता है; द्वितीय) संरचनाओं के आसपास haloing. यह आसपास के ढांचे की तुलना में उज्जवल संरचनाओं से संकेत के बहुत असमान स्तर से हो सकता है, तेल के अपवर्तनांक की एक बेमेल और नमूना या छवि होने के लिए पर्याप्त "संरचना" युक्त भी बेढब जा रहा है और नहीं में संरचनाओं की वजह से हो सकता है कलन विधि द्वारा मान्यता प्राप्त; आम तौर पर उच्च पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए, छवि में शोर अनुपात करने के लिए एक कम संकेत से जो परिणाम iii) 'honeycombing'; चतुर्थ) XY में लम्बी फैला रहे हैं कि संरचनाओं / कारण तेल और नमूना का अपवर्तनांक बेमेल हो सकता है. यह विरूपण साक्ष्य एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए विचार करने के लिए मुश्किल है. यह इस तकनीक का उपयोग करने के लिए शुरू जब नए उपयोगकर्ताओं छवि व्याख्या और विश्लेषण पर सलाह के लिए एक अनुभवी सिम शोधकर्ता परामर्श की सिफारिश की है.
सभी फ्लोरोसेंट जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों के साथ के रूप में, यह आयात हैचींटी ध्यान से photobleaching और न्यूनतम विरूपण साक्ष्य के साथ छवियों को फिर से संगठित करने के लिए आवश्यक पर्याप्त उत्सर्जन संकेत के साथ कोशिकाओं की phototoxicity की डिग्री को कम करने के क्रम में उत्तेजना ऊर्जा इनपुट संतुलन. अत्यधिक photobleaching (एक z ढेर अधिग्रहण भर में अधिक से अधिक से अधिक 30%) खंगाला छवि में एक स्ट्राइपिंग पद्धति को बढ़ावा मिलेगा. SCMOS कैमरों के उपयोग के साथ, सुपर संकल्प छवियों सफलतापूर्वक पृष्ठभूमि ऊपर 1,000 मायने रखता है जितनी कम उत्सर्जन संकेत के साथ कच्चे छवियों से खंगाला जा सकता है. यह बहुत ही कम जोखिम बार जिससे photobleaching कम करने और प्रत्येक फ्रेम के लिए तेजी से कब्जा सक्षम बनाने के लिए अनुमति दे सकते हैं. यह भी कोशिकाओं उत्तेजना ऊर्जा इनपुट से उबरने के लिए फ्रेम के बीच समय की मात्रा बढ़ जाती है. प्रत्येक व्यक्ति के फ्रेम के लिए कब्जा समय बहुत ही कम किया जा सकता है के रूप में इसके साथ ही, एक व्यक्ति को पकड़ने के दौरान 'गति कलंक' द्वारा शुरू विरूपण साक्ष्य की डिग्री इस पद्धति के उपयोग के साथ कम हो जाता है.
इस vari3 डी सिम का व्यावहारिक बैक्टीरिया कोशिका जीव द्वारा लाइव इमेजिंग के लिए अन्य उपलब्ध सुपर और उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीकों से अधिक अन्य लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. सभी 3 आयामों में संकल्प में 2 गुना वृद्धि हुई है और एक नमूना में 30 माइक्रोन के लिए ऊपर छवि की क्षमता एक प्रयोग के दौरान पूरे जीवाणु (और स्तनधारी) कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. सामान्यतः क्षणभंगुर लहर में प्रदर्शन कर रहे हैं कि इस तरह के एकल अणु स्थानीयकरण के रूप में तकनीक एक नमूना में प्रवेश की गहराई को प्राप्त नहीं कर सकते हैं और पूरे कोशिकाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. इस तकनीक के लिए उच्च नमूना गहराई की अनुमति है कि हाल के अग्रिमों पूरे कोशिकाओं के बेहतर अक्षीय संकल्प में हो सकता है. साथ ही, यह भी स्थानिक संकल्प के रूप में, पर कब्जा कर लिया जा सकता है और कब्जा फ्रेम दर और परम हासिल स्थानिक संकल्प के बीच समझौता पड़ सकता है जो फ्रेम दर में सीमित कर रहे हैं हासिल करने के लिए कच्चे छवियों के हजारों की आवश्यकता है कि एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक पर निर्भर है ईव की संख्याएक परिभाषित अंतरिक्ष के भीतर दर्ज एनटीएस. पर कब्जा कर लिया तख्ते की संख्या कम एक कम स्थानिक संकल्प में परिणाम होगा लेकिन ब्याज की जैविक प्रक्रिया के लिए आवश्यक अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. फ्रेम के बीच वसूली समय की राशि भी है, जिससे समय श्रृंखला प्राप्त किया जा सकता है, जिस पर अवधि और आवृत्ति सीमित जीवित कोशिकाओं में phototoxicity कम करने के लिए वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है. ऐसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) या इलेक्ट्रॉन cryotomography (ईसीटी) के प्रस्ताव के रूप में उच्च संकल्प तकनीक 3 डी सिम (और अन्य सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक) से अधिक संकल्प वृद्धि हुई है लेकिन तय नमूनों पर किया जाना चाहिए. फिक्सिंग और प्रसंस्करण कलाकृतियों को पेश हो सकता है और लेबलिंग की कमी व्याख्या मुश्किल कर सकते हैं. लेबल मुक्त ईसीटी गरीब विपरीत है और चारों ओर 500-200 एनएम 24 का नमूना पैठ गहराई प्राप्त कर सकते हैं, तो ब्याज की प्रोटीन की पहचान की जा सकती है, भले ही एक पूरी बैक्टीरिया कोशिका में प्रोटीन की संरचना देखा नहीं जा सकता.लेबलिंग इस तरह के immunogold साथ के रूप में उन्हें, में इस्तेमाल किया जा सकता है, तब भी जब इमेजिंग केवल 2 डी में किया जाता है. 3 डी पतली सेक्शनिंग और वर्गों के कम्प्यूटेशनल पुनर्निर्माण के साथ ही प्राप्त है. पतली सेक्शनिंग एक अनुभवी तकनीशियन की आवश्यकता है लेकिन समस्याग्रस्त हो और विरूपण साक्ष्य के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लाइव या तय कोशिकाओं के साथ, 3 डी सिम एक विशिष्ट तरीके से एम्बेड करने और कोशिकाओं को तेजी से एक के पास देशी राज्य में इमेजिंग के लिए तैयार किया जा सकता है की जरूरत नहीं है.
इस विधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में कम से कम अनुभव के साथ शोधकर्ताओं द्वारा लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. प्रयोग के रूप में लंबे समय से यह प्रतिदीप्ति या अनुचित पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न नहीं करता है के रूप में स्वस्थ कोशिका समारोह का समर्थन है कि मीडिया में प्रदर्शन किया जा सकता है. बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए, यह जटिल और कम से कम मीडिया या बैक्टीरिया कोशिका गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए ठोस या अर्द्ध ठोस मीडिया के उपयोग से कई प्रकार के उपयोग की अनुमति सकता है. पहले से ही फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) fusions इंजीनियर और की कार्यक्षमता का परीक्षण किया है, जो कई जीवइन fusions आगे इंजीनियरिंग और नए photoactivatable एफपी fusions के साथ सत्यापन के बिना तेजी से इस प्रौद्योगिकी का समय लग सकता है. हम एक सामान्य अवलोकन के रूप में, पाया कि एस ऑरियस बी से एफपी fusions के साथ इमेजिंग के दौरान photobleaching के लिए अतिसंवेदनशील था subtilis. ग्रिड पैटर्न एक भौतिक झंझरी द्वारा उत्पन्न किया गया था, जहां हमारे मूल 3 डी सिम तरीकों का उपयोग कर, हम एस के एक नंबर के साथ लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने में असमर्थ थे ऑरियस एफपी fusions. हालांकि, इस उन्नत f3D सिम विधि के साथ, हम छवि को इन एफपी fusions में सक्षम थे और इन टैग प्रोटीन की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए कम समय श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं. यह सबसे शायद इमेजिंग के लिए आवश्यक है और सेल वसूली के लिए फ्रेम के बीच समय में वृद्धि हुई कम जोखिम बार की वजह से है.
OMX ब्लेज़ 3 डी सिम अपेक्षाकृत आसानी से एक भी प्रयोगशाला या एक कोर इमेजिंग सुविधा में लागू किया जा सकता है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रौद्योगिकी है. केयर आरती से बचने के लिए तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए लिया जाना चाहिएगरीब नमूना तैयार करने या गरीब छवि पर कब्जा करने के कारण तथ्यों. तकनीक में महारत हासिल हो जाने के बाद, बैक्टीरिया जैसे छोटे जीवों में प्रोटीन संरचना के अध्ययन और गतिशीलता एकल या बहु रंग प्रतिदीप्ति में किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media |
N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization |
Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2%?? after autoclaving |
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm) |
Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22×22 No 1 Thickness |
35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35mm, Glass: Ø 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol |
Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Combined Orbital/Linear Shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
UV visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use |
softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |