Summary
Graden af vaskulær dysfunktion og bidrage fysiologiske mekanismer kan vurderes hos patienter med kronisk nyresygdom ved måling pulsåren flow-medieret dilatation aorta puls-bølge hastighed og vaskulær endotelcelle proteinekspression.
Abstract
Patienter med kronisk nyresygdom (CKD) har signifikant øget risiko for hjerte-kar-sygdom (CVD) i forhold til den almindelige befolkning, og det er kun delvist forklares med de traditionelle CVD risikofaktorer. Vaskulær dysfunktion er en vigtig ikke-traditionel risikofaktor, kendetegnet ved, vaskulær endotel dysfunktion (oftest vurderes som nedsat endotel-afhængig dilatation [EDD]) og afstivning af de store elastiske arterier. Mens forskellige teknikker eksisterer for at vurdere EDD og store elastiske arterie stivhed, de mest almindeligt anvendte er pulsåren flow-medieret dilatation (FMD BA) og aorta puls-bølge hastighed (aPWV), hhv. Begge disse invasive foranstaltninger vaskulær dysfunktion er uafhængige prædiktorer for fremtidige kardiovaskulære hændelser hos patienter med og uden nyresygdom. Patienter med CKD demonstrere både forringet FMD BA, og øget aPWV. Mens de nøjagtige mekanismer, som vaskulær dysfunktion develops i CKD er ufuldstændigt forstået, øget oxidativt stress og en efterfølgende reduktion af nitrogenoxid (NO) biotilgængelighed er vigtige bidragydere. Cellulære ændringer i oxidativ stress kan vurderes ved at indsamle vaskulære endotelceller fra antecubital vene og måling af protein-ekspression af markører for oxidativt stress ved hjælp af immunfluorescens. Vi giver her en diskussion af disse metoder til at måle FMD BA, aPWV og vaskulær endotel celle protein udtryk.
Introduction
Kronisk nyresygdom (CKD), er et stort problem for folkesundheden, der har nået epidemiske proportioner, der påvirker ~ 11,5% af befolkningen i USA alene 1. Risikoen for kardiovaskulær død eller kardiovaskulær hændelse hos patienter med CKD er steget betydeligt sammenlignet med den generelle befolkning 2-4. Selv patienter med CKD udviser en høj forekomst af traditionelle kardiovaskulære risikofaktorer, dette forklarer kun en del af deres øgede incidens af kardiovaskulær sygdom (CVD) 5. Vaskulær dysfunktion er en vigtig utraditionel kardiovaskulær risikofaktor få øget anerkendelse inden for nefrologi 6-9.
Mens mange ændringer, der sandsynligvis bidrager til udviklingen af arteriel dysfunktion, blandt dem til størst bekymring, er udviklingen af vaskulær endotel dysfunktion, oftest vurderes som nedsat endotel-afhængig dilatation (EDD), og afstivning af laRGE elastiske arterier 10. Forskellige teknikker eksisterer for at vurdere EDD og store elastiske arterie stivhed, men den mest almindeligt anvendte er pulsåren flow-medieret dilation FMD BA og aorta puls-bølge hastighed (aPWV), hhv. En anden almindeligt anvendt teknik til at vurdere EDD måler underarm blodgennemstrømning respons på farmakologiske midler, såsom acetylcholin ved hjælp af venøs okklusion plethysmografi 11,12. Men denne metode kræver kateterisation af pulsåren, hvilket er mere indgribende end FMD BA og kan være kontraindiceret hos patienter med CKD. En suppleant teknik til at vurdere arteriel stivhed er at måle den lokale arterielle compliance (det modsatte af stivhed) i halspulsåren, selv om dette ikke er så udbredt, valideret med kliniske effektmål som aPWV 13.
Patienter med CKD demonstrere både forringet FMD BA 14-16 og øget aorta puls-bølge hastighed aPWV 13,17,18, selv før behøver dialyse. Vigtigere fra et klinisk perspektiv, begge disse invasive foranstaltninger vaskulær dysfunktion er uafhængige prædiktorer for fremtidige kardiovaskulære hændelser og mortalitet både hos patienter med CKD 19-21, såvel som i andre populationer 22-26. Disse teknikker kan anvendes til at studere forskellige befolkningsgrupper med risiko for CVD, herunder patienter med CKD.
De nøjagtige mekanismer, som arteriel dysfunktion udvikler sig i CKD er ufuldstændigt forstået; imidlertid reduceret nitrogenoxid (NO) biotilgængelighed er en kritisk bidragyder 27-30 og en fælles mekanisme for både Hæmmede EDD og forøget arteriel stivhed 10,31. I CKD er oxidativ stress øges og bidrager til reduktion i NO biotilgængelighed 32-34. Oxidativ stress defineres som overdreven biotilgængelighed af reaktive oxygenspecies (ROS) i forhold til antioxidantforsvar. Fysiologiske stimuli, including inflammatorisk signalering, fremmer oxidant enzymsystemer til at producere ROS, herunder superoxidanion (O 2 ● -) (f.eks oxidationsmiddel enzymet NADPH oxidase.) 35. Produktionen af superoxid sidste ende fører til reducerer biotilgængeligheden af nitrogenoxid (NO).
Nedsat NO biotilgængelighed igen kan bidrage til udviklingen af CKD, som endotel dysfunktion er en uafhængig prædiktor for hændelsen CKD 36. Dette er i overensstemmelse med data fra dyr indikerer, at eNOS hæmning inducerer hypertension (systemisk og glomerulær), glomerulær iskæmi, glomerulosklerose og Tubulo-interstitielle skade 37.. Faktisk reducerede NO biotilgængelighed synes nødvendig for udvikling og progression af eksperimentel nyresygdom, der efterligner sygdomme hos mennesker, hvilket tyder på en central rolle for endotel dysfunktion i human CKD 38,39.
Markører for vaskulær oxidativt stress kan vurderes på vascular endotelceller indsamlet fra menneskelige forsøgspersoner ved hjælp af en teknik oprindeligt udviklet af Colombo et al. 40 og modificeret Seals et al 41-43. Brug 2 sterile J-ledninger, opsamles celler fra antecubital vene, genvundet, fikseret og senere identificeret som endotelceller og analyseret for ekspression af proteiner af interesse ved hjælp af immunfluorescens.
Vi giver her en diskussion af denne metode, der kan bruges til a) foranstaltning FMD BA; b) måler aPWV; c) måler vaskulær endotelcelle protein ekspression af markører for oxidativt stress. Der er fokus på patienter med CKD, som ikke kræver kronisk dialyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne i Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB).
1.. Forberedelse til testsession
- Deltagerne skal følge disse begrænsninger for mest præcise målinger: 12 timer fast fra mad og koffein, 12 timer tilbageholdenhed fra motion, 12 timer tilbageholdenhed fra at ryge, hvis det er relevant,> 4 halveringstid tilbageholdenhed fra medicin, hvis det er muligt (måske ikke være muligt i en befolkning som CKD-patienter), og præmenopausale kvinder bør testes i dage 1-7 af menstruationscyklus for at minimere hormonelle påvirkninger.
- Forbered 500 ml af dissociation buffer ved tilsætning af 2 ml 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,05 g heparin (180 USP enheder / mg) og 2,5 g okseserumalbumin til 476,8 ml phosphatbufret saltvand (PBS) ved pH på 7,4. Dette kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder.
- Tænd ultralyd, computer og non-invasiv HemodynamicWorkstation (NIHem, arteriel stivhed udstyr). Tilslut kablerne som udsender ultralyd til computeren R-bølge udløser kassen.
2.. Indsamling og behandling af vaskulære endotelceller
- En uddannet sygeplejerske eller læge udfører samling (trin 2,2-2,5, 2,7) og en forsker indsamler og behandler ledningerne (trin 2,6, 2,8 til 2,19)
- Prep antecubital site med et aktuelt antiseptisk, anvende en årepresse, find vene, og cannulate med en 18 G kateter. Placer en heplock adapter på enden af IV.
- Sæt på sterile handsker og sætte sterile fenestrated forhæng over sitet.
- Læg 2 J-ledninger på gardiner. Træk den bue af den "J" at rulle ud på "J"-form fra begge ledninger.
- Tag hætten af heplock og foder J-ledning i vene omkring 8 cm. Skub frem og tilbage flere gange, før wiren fjernes. Undgå grov blod på wiren.
- Brug bidetang til at klippe ledningerne, så de passer ind i en50 ml konisk rør indeholdende ~ 30 ml dissociation buffer
- Gentag trin 2.5 for anden wire.
- Gentag trin 2.6 for anden wire. Returrøret vådt laboratorium.
- Hægte ledningerne med en tang og holde ledningerne indersiden af røret, men over opløsningen. For 10 minutter, skal du bruge en motoriseret pipette til gentagne gange at indsamle dissociation buffer fra 50 ml konisk rør, og slip den, så det løber ned på længden af ledningerne til at skylle og vibrere ledningerne, så ryst overskydende væske fra ledningerne i røret.
- Centrifugeres i 7 min ved 400 xg og 4 ° C.
- Formaldehyd løsning i folie dækket rør Forbered ved at kombinere 100 ml formaldehyd løsning + 900 ml PBS.
- Langsomt fjerne røret fra centrifuge, tænde for vakuumpumpe, placere en pipettespids på enden af sugeslange og efterlade ~ 400 ml i røret, støvsugning fra resten uden at forstyrre bundfaldet.
- Dæk med folie og pipette 1 ml formaldehyd løsning irøret for at løse prøven. Må ikke resuspendere. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered 8 dias ved mærkning med emne og studiebesøg information og tegne en oval på de enkelte dias med en pap pen.
- Tilsættes 15 ml PBS, resuspender og centrifuger i 5 minutter ved 400 xg og 4 ° C.
- Gentag trin 2.15, tilsættes 12 ml PBS, resuspender og centrifuger i 6 min ved 400 xg og 4 ° C.
- Langsomt fjerne røret fra centrifuge, tænde for vakuumpumpe, placere en pipettespids på enden af sugeslange og lad ~ 2 ml i røret, støvsugning fra resten uden at forstyrre bundfaldet.
- Resuspender og pipette jævnt over de 8 dias i de ovale områder.
- Sted i inkubator ved 37 ° C i 5 timer og derefter opbevares ved -80 ° C, indtil klar til analyse (prøverne vil være fint i mange år).
3.. Vurdering af FMD BA og aPWV
- Har forskning emne ændring i engangs shorts og har him / hendes løgn liggende i en rolig, dæmpet, klima kontrollerede rum.
- Placer passende antal EKG for den specifikke ultralyd og arteriel stivhed enhed (denne procedure bruger ikke-invasiv Hæmodynamik Workstation [NIHem] for at måle arteriel stivhed, som kræver 4 elektroder), og blodtryksmanchet på emne.
- Efter 20 minutter begynder blodtryksmålinger. Udfør mindst 3, og gentag indtil målingerne er inden for 5 mmHg, hvile 2 min mellem hver læsning.
- Begynd tonometri ved palpating for pulsåren puls og placere tonometer at optage brachialis kurver ved hjælp af programmet.
- Gentag for de radiale, femorale og halspulsårer.
- Mål afstanden til hver af disse websteder fra supersternal hak ved hjælp af et målebånd (brachialis, radiale og carotis) og brugerdefinerede lineal / skydelære (femoral).
- Beregn carotis-brachialis, carotis-radial, og carotis-lårbens (aPWV) ved hjælp af programmet.
- Stedunderarm blodtryksmanchet lige distalt for olecranon proces og optage mindst 10 hjertecyklusser af baseline brachialarterien ultralyd billeder og blodgennemstrømning hastighedsmålinger, med en vaskulær softwaren indstillet til at udløse tilstanden. En mekanisk arm kan anvendes til at stabilisere ultralydsonden hvis det ønskes.
- Pump underarm blodtryksmanchet til 250 mmHg og begynde timeren. Instruer deltageren til at forblive meget endnu.
- Starte optagelse hastigheder med en vaskulær softwaren indstillet til at udløse tilstand, når timeren læser 4:45. Trigger frigive manchetten på 5:00 og ændre ultralyd til at optage B-mode (diameter) billeder, når uret læser 5:10.
- Fortsætte optagelsen, indtil uret læser 7:00.
- Optag mindst 10 hjertecyklusser baseline pulsåren ultralyd billeder med en vaskulær softwaren indstillet til at udløse tilstanden.
- Tag emne blodtryk. Hvis systolisk blodtryk> 100 mmHg, placeres 0,4 mg sublingual nitroglycerin under emnet &# 39, s tungen og begynder timer, medmindre patienten har en anden kontraindikation.
- Begynd optagelse B-mode (billeder diameter), når uret læser 3:00 med den vaskulære softwaren indstillet til at udløse tilstanden.
- Stop optagelsen, når uret læser 8:00.
- Overvåg blodtryk indtil det vender tilbage til baseline
4.. Forberedelse Menneskelige navlevene Endotel Cell (HUVEC) Styring Slides
- Grow HUVEC'er til passage 5-6 og ~ 80% konfluens.
- Trypsinisér med 3 ml trypsin eller hvad der er nødvendigt for skålen / kolben.
- Neutralisere trypsin under anvendelse af et lige så stort volumen trypsin neutraliserende opløsning.
- Centrifuger ved 200 xg for ~ 5 min og fjerne trypsin og neutraliserende opløsning ved vakuum.
- Resuspender i ~ 10 ml PBS for at vaske.
- Centrifuger ved 200 x g ~ 5 min. Fjern PBS.
- Fjern PBS og fastsætte 1800 pi PBS + 200 pi formaldehyd.
- Resuspender i PBS (~ 10 ml).
- Centrifuger ved 200 xg ~5 min. Fjern PBS, resuspender i et passende volumen til at tilføje ~ 200 ul pr dias.
- Opbevar dias ved -80 ° C, indtil klar til analyse (prøverne vil være fint i mange år).
5.. Farvning af vaskulære endotelceller
- Tag slides ud af -80 ° C fryser og vente 5 minutter ved stuetemperatur (denne procedure er for et parti på 10 dias, herunder en HUVEC kontrol slide).
- Tør overskydende vand med en delikat opgave tørre (ikke røre midten af dias).
- Re-hydrat dias ved at tilføje ændret PBS til hvert dias og efterlade dem i 10 min.
- Mens dias står, forberede 5% æsel serum og andre løsninger.
- Forbered 5% æsel serum ved at tilsætte 300 pi æsel serum til 5.700 pi ændret PBS (til en pH-værdi på 7,4) i op til 10 dias (øge dette beløb til mere).
- Fortynd det primære antistof af interesse i 1000 pi 5% serum. For eksempel nitrotyrosine og NADPHoxidase (1:300 og 1:1,500) kan anvendes som markører for oxidativt stress.
- Forbered sekundær AF568 ved at fortynde 5 ul AF568 til 1.500 μll 5% serum.
- Forbered VE cadherin ved at fortynde 2 pi VE cadherin til 1000 pi 5% serum.
- Forbered AF488 ved at fortynde 5 ul VE Cadherin til 1.000 pi 5% serum.
- Hold AF568, VE cadherin og AF488 under folie gennem hele processen, og derefter placere på rocker i 4 ° C køleskab mens de forbereder dias.
- Efter 10 minutter af rehydrering, tørre dias med en delikat opgave tørre.
- Tilføj 5% æsel serum i 60 min og læg et stykke plastic paraffin film over kredsede område for at sikre fuldstændig dækning af kemikaliet.
- Kassér plast paraffin film og tørre dias med en delikat opgave tørre. Må ikke vaskes. Tilføj primære antistof i 60 min og læg et stykke plastic paraffin film over kredsede område for at sikrefuldstændig dækning af kemikaliet.
- Kassér plast paraffin film, skyl med ændret PBS fra sprøjteflaske og suge i slide kolonner i 5 min. Mens dias er iblødsætning, flytte dem ind i et mørkt rum. Arbejde i mørke for alle resterende trin.
- Tørre lysbilleder med Kimwipes, tilføje AF568 (sekundært antistof) i 45 min og læg et stykke plastic paraffin film over kredsede område for at sikre fuldstændig dækning af kemikaliet. Dæk fra lys.
- Kassér plastik paraffin film i biologisk farligt affaldsbeholder. Skyl med ændret PBS fra sprøjteflaske, og derefter lægges i blød i kolonner i 5 min.
- Tørre lysbilleder med Kimwipes, derefter tilføje VE Cadherin i 60 min og læg et stykke plastic paraffin film over kredsede område for at sikre fuldstændig dækning af kemikaliet. Dæk fra lys.
- Kassér plastik paraffin film i biologisk farligt affaldsbeholder. Skyl med ændret PBS fra sprøjteflaske, og derefter lægges i blød i kolonner i 5 min.
- Tørre dias meden delikat opgave tørre, tilføje AF488 i 30 min og læg et stykke plastic paraffin film over kredsede område for at sikre fuldstændig dækning af kemikaliet. Dæk fra lys.
- Kassér plastik paraffin film i biologisk farligt affaldsbeholder. Skyl med ændret PBS fra sprøjteflaske, og derefter lægges i blød i kolonner i 5 min.
- Tør dias med en delikat opgave tørre og lad objektglassene tørre i 20 min. Dæk fra lys.
- Tilføj en dråbe kun fluoroshield montering medium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole hydrochlorid (DAPI) til hvert dias og dækker hver med en dækstrimmel.
- Anbring objektglassene i 4 ° C køleskab dækket med folie. Imaging skal være afsluttet inden for 48 timer.
6.. Billedbehandling og analyse af vaskulære endotelceller
- Forbered mikroskop til billeddannelse farvede endotelceller i henhold til specifikationerne i den specifikke mikroskop. En enkelt blindet tekniker bør analysere en bestemt protein for et batlm af celler.
- Scanne dias systematisk. Identificer endotelceller ved positiv farvning for VE cadherin og bekræft nukleare integritet ved positiv farvning for DAPI.
- Billede 30 celler pr dias til senere analyse. Gentag for hver dias i farvede parti, herunder HUVEC.
- Analyser intensiteten af farvning for det primære antistof af interesse ved anvendelse af en kvalitativ software.
- For at minimere den mulige konfunderende effekt af forskelle i intensitet farvning mellem forskellige farvningsprocedurer sessioner, rapport værdier som forholdet mellem protein udtryk i de indsamlede endotelceller til det samme protein udtryk i HUVEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FMD BA er kvantificeret som peak ændring i diameter brachialarterien efter reaktiv hyperæmi. Således er diameteren i hvile i forhold til diameter efter udløbet af en 5 min blodtryksmanchet okklusion periode (figur 1). Panel A viser en repræsentativ ultralydsbillede af brachialarterien, og panel B viser en graf af R-bølge gated ændring i diameter fra manchetfrigivelse til 2 minutter efter, som opnået ved anvendelse af kommercielt tilgængeligt software. Da ændringen er ofte ganske minimal (I figur 1 er ændringen 4,8%), kan små forskelle i målingen have stor indvirkning på resultaterne. Anvendelse af kommercielt tilgængelige automatiserede kant afsløring software er stærkt anbefales for at minimere bias og potentielle fejl i målingen 44,45. Som incitament til dilatation under reaktiv hyperæmi kan variere mellem grupper eller betingelser der sammenlignes, bør shear rate beregnes ved hjælp af Doppler blodgennemstrømninghastigheder og FMD BA bør justeres for forskelle, når gældende 46,47.
aPWV beregnes med minimal operatør input fra de fleste kommercielt tilgængelige systemer, herunder NIHem bruges i vores forskning. R-bølge af EKG i forhold til "fod" af bølgeformen på et givet sted, og tidsforskellen beregnes (figur 2) for halspulsåren (panel A) og den femorale arterie (Panel B). Målingerne distance anvendes i forbindelse med tidsforskellene at beregne en hastighed. aPWV refererer til hastighed mellem halspulsåren til den femorale arterie (dvs.. langs aorta).
Immunfluorescens analyse af vaskulære endotelceller kan give cellulær bevis for omfanget af oxidativ stress. For at tage højde for forskelle i farvningsintensitet mellem farvnings sessioner, niveauet af fluorescens af et givet protein for hvert enkelt emne (repræsentativt ima ges i figur 3 viste panel A) i forhold til fluorescensen af kontrol slide HUVEC (repræsentative billeder, der vises i figur 3 Panel B). Således kan sammenlignes forskelle i protein udtryk hverken mellem grupperne eller på tværs (f.eks under et interventionsstudie).
Figur 1.. Repræsentant baseline brachialarterien diameter opnået under vurderingen af pulsåren flow-medieret dilatation (FMD BA). A) i en patient med kronisk nyresygdom (CKD). B) R-bølge gated ændring i diameter fra manchetfrigivelse til 2 min efter er vist grafisk, som er opnået ved hjælp af kommercielt tilgængelige software.target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Repræsentative resultater udskrift fra vurdering af aPWV i en patient med CKD. A) Tidsforsinkelse fra R-bølge af EKG til foden af halspulsåren, B) tidsforsinkelse fra R-bølge af EKG til foden af den femorale arterie (tfoot), overlejret med carotis bølgeform. Begge paneler viser også de indlæste afstande fra suprasternal hak til de respektive steder (repræsenteret ved bogstavet D, i cm). Den beregnede aPWV værdi vises i panel B (repræsenteret ved bogstaverne PWV, i cm / sek). Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>
Fig. 3. Repræsentative billeder af proteinekspression. A) DAPI (nuklear integritet, blå), VE Cadherin (positiv endothelcelle identifikation grøn) oxidationsmiddel enzymet NADPH oxidase (protein af interesse, rød) fra celler opsamlet fra en patient med CKD B) og for et menneske navlevene endothelcelle (HUVEC) slide kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indhentning bedre resultater FMD BA og aPWV kræver at erhverve høj kvalitet ultralyd billeder og trykbølgeformer, hhv. Centralt i dette er hensigtsmæssigt og fortsat uddannelse og brug af hver teknik af operatøren 44. Desuden er det afgørende at kontrollere for så mange eksterne variabler, der kan påvirke resultaterne som muligt ved at standardisere test session (fx før 12 timer hurtigt, klima kontrollerede rum, etc.) 44,45. Som nævnt ovenfor, er brugen af kommercielt R-bølge gated erhvervelse software og edge-afsløring software stærkt anbefales for at minimere bias og potentielle fejl i målingen 44,45. Når MKS BA er svækket, kan dette være enten på grund af forringet NO frigivelse fra endotel eller på grund af nedsat reaktionsevne de vaskulære glatte muskler til NO frigivet. Sublingual nitroglycerin administreres til at styre for at reagere på den glattemuskel cellelag til et eksogent nitrogenoxid donor, med henblik på at konkludere, at enhver forringelse i FMD BA er specifik evne til vaskulære endotel at producere nitrogenoxid 44,45.
Da målingen er en hastighed, er kritiske nøjagtige målinger af både distance og tid. Protokollen vi har beskrevet er baseret på den anvendt i Framingham Heart Study 24 metodologi. Anvendelse af hævede calipre snarere end et målebånd forbedrer nøjagtigheden af målingen af afstanden fra suprasternal hak til femoralarterien ved at tage en direkte vej snarere end potentiel måling løbet abdominal fedme. Et klart "fod" af et rent bølgeform er absolut nødvendigt for beregning af tidsforskellen fra R-bølge af EKG til impuls på målestedet (se figur 2).
Mens alternative teknikker er til rådighed til at vurdere både endotelfunktion og arteriale stivhed, FMD BA og aPWV er begge almindeligt anvendt i klinisk forskning, fordi de er ikke-invasiv og veletableret som mellemled resultater. Desuden er de godt valideret på tværs af forskellige befolkningsgrupper og uafhængigt forudsigende for kardiovaskulære hændelser og mortalitet 19-26. Således kan de bruges som surrogat endpoints i kliniske undersøgelser, der vurderer effekten af en intervention for at reducere risikoen i en given befolkning, såsom patienter med CKD. Ændring af disse teknikker er ikke forpligtet til specifikt at studere patienter med CKD, sammenlignet med andre befolkningsgrupper med risiko for CVD.
Men der er vigtige begrænsninger til både mund BA og aPWV at fortjeneste diskussion. FMD BA vurderer vaskulær endotel funktion af en stor kanal arterie (brachialarterien), giver derfor ikke et indeks for mikrovaskulære endotel funktion. En separat teknik med venøs okklusion plethysmography er bedre egnet til at vurdere sidstnævnte. Men denne metode kræver kateterisation af pulsåren, hvilket er mere indgribende end FMD BA og kan være kontraindiceret hos patienter med CKD. Desuden måling af mund-og klovesyge BA kræver langvarige og specifik uddannelse med henblik på at blive udført godt. aPWV giver et indeks for store elastiske arterie stivhed, som kan afvige fra den lokale arteriel stivhed (såsom halspulsåren). En suppleant teknik til at vurdere arteriel stivhed er at måle den lokale arterielle compliance (det modsatte af stivhed) i halspulsåren, selv om dette ikke er så udbredt, valideret med kliniske effektmål som aPWV 13. Desuden kan bidrag NO som en afgørende faktor for aorta stivhed varierer med karbanen 48.. Sidste, der er potentielle forvirrer til fortolkning af både mund BA og aPWV der behøver at blive målt og statistisk korrigeret for passende, herunder baseline diameter og shear sats for mund-og klovesyge BA 45, og puls og blodtryk for aPWV 49.
En vigtig overvejelse i indsamlingen af vaskulære endotelceller er at minimere blod på J-ledninger og efterfølgende på dias, således at endotelceller kan identificeres med minimale røde blodlegemer, der overlapper hinanden i billeder. Dette kan opnås med uddannelse for korrekt teknik samt passende vask når inddrive cellerne. Ved analyse dias, er det afgørende, at fluorescens kan objektivt kvantificeres og billederne er klare, uden megen baggrund eller overlapning med andre celler. Optimering af fortyndinger til farvning og teknik til mikroskopi analyse forud for analysen af undersøgelsens prøver er vigtige skridt. Af note, celleudbytte af denne teknik er ~ 600 vaskulære endotelceller pr indsamling, en utilstrækkelig mængde af det samlede mRNA er til rådighed til at måle genekspression, hvilket begrænser vores sonde til immunofl, fluorescerende farvning af proteiner af interesse.
Ud over de, der præsenteres for vurderingen vaskulær oxidativ stress, cirkulerende eller urin markører kan anvendes til at vurdere oxidativt stress 12,50. Imidlertid kan de være mindre reflekterende af niveauet af oxidativt stress specifikt niveau af det vaskulære endotel. Ved hjælp af disse markører i forbindelse med de præsenterede teknikker kan give den bedste indikation af det generelle niveau for oxidativ stress.
Vi har givet en oversigt over metoder, der kan anvendes til at måle MKS BA, aPWV og vaskulær endotelcelle proteinekspression. Disse teknikker er ikke kun egnet til patienter med CKD, men også i andre populationer med øget risiko for hjerte-kar-sygdom. Tilsammen giver de indsigt i vaskulær endotel dysfunktion, store elastiske arterie stivhed og bidrage fysiologiske mekanismer, herunder oxidativ stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Nina Bispham for hendes teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (12POST11920023) og NIH (K23DK088833, K23DK087859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
- Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
- Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
- Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
- Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
- Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
- Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
- Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
- vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
- Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
- Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
- Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
- Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
- Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
- Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
- Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
- Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
- Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
- Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
- Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
- Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
- Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
- Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
- Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
- Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
- Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
- Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
- Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
- Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L.
- Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
- Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
- Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
- Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
- Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
- Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
- Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
- Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
- Nakagawa, T., Johnson, R. J.
- Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
- Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
- Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
- Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
- Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
- Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
- Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
- Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
- Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).
