Summary
Le degré de dysfonction vasculaire et contribuer mécanismes physiologiques peut être évaluée chez les patients atteints de maladie rénale chronique par la mesure de la dilatation de l'artère brachiale médiée par le flux, la vitesse des ondes de pulsation aortique et vasculaire endothéliale expression de la protéine de la cellule.
Abstract
Les patients atteints de maladie rénale chronique (IRC) ont augmenté de façon significative le risque de maladies cardiovasculaires (MCV) par rapport à la population générale, et ce n'est que partiellement expliqué par des facteurs de risque traditionnels de MCV. Dysfonction vasculaire est un important facteur de risque de non-traditionnelle, caractérisée par un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire (le plus souvent évaluée comme douteux endothélium-dépendante dilatation [EDD]) et le raidissement des grandes artères élastiques. Bien que diverses techniques existent pour évaluer EDD et grande rigidité de l'artère élastique, les plus couramment utilisés sont la dilatation de l'artère brachiale médiée par le flux (FMD BA) et de la vitesse des ondes de pulsation aortique (aPWV), respectivement. Ces deux mesures non invasives de la dysfonction vasculaire sont des facteurs prédictifs indépendants de futurs événements cardiovasculaires chez les patients avec et sans maladie rénale. Les patients atteints de néphropathie chronique démontrent à la fois une altération de la fièvre aphteuse BA, et augmenté aPWV. Bien que les mécanismes exacts par lesquels le dysfonctionnement vasculaire dévePI était en CKD sont encore mal compris, augmentation du stress oxydatif et une réduction subséquente de l'oxyde nitrique (NO) de biodisponibilité sont des contributeurs importants. Modifications cellulaires dans le stress oxydatif peuvent être évaluées par la collecte de cellules endotheliales vasculaires dans la veine du pli du coude et la mesure de l'expression des protéines de marqueurs de stress oxydatif par immunofluorescence. Nous fournissons ici une discussion de ces méthodes pour mesurer la fièvre aphteuse BA, aPWV, et l'endothélium vasculaire expression de la protéine de la cellule.
Introduction
La maladie rénale chronique (IRC) est un problème majeur de santé publique qui a atteint des proportions épidémiques, touchant ~ 11,5% de la population aux États-Unis seulement 1. Le risque de décès d'origine cardiovasculaire ou un événement cardiovasculaire chez les patients atteints de néphropathie chronique est significativement augmentée par rapport à la population générale 2-4. Bien que les patients atteints de néphropathie chronique présentent une prévalence élevée de facteurs de risque cardiovasculaire traditionnels, ce que explique en partie l'incidence accrue de maladies cardiovasculaires (MCV) 5. Dysfonction vasculaire est importante non traditionnel facteur de risque cardiovasculaire obtenir une reconnaissance accrue dans le domaine de la néphrologie 6-9.
Alors que de nombreux changements susceptibles de contribuer au développement d'un dysfonctionnement artériel, parmi ceux les plus préoccupants sont le développement de la dysfonction endothéliale vasculaire, le plus souvent évaluée comme douteux dilatation endothélium-dépendante (EDD), et la rigidification de l'rge artères élastiques 10. Différentes techniques existent pour évaluer EDD et grande rigidité de l'artère élastique, mais les plus couramment utilisés sont la dilatation médiée par le flux l'artère brachiale fièvre aphteuse BA et de la vitesse des ondes de pulsation aortique (aPWV), respectivement. Une autre technique couramment utilisée pour évaluer EDD est la mesure de la réponse du flux sanguin de l'avant-bras à des agents pharmacologiques tels que l'acétylcholine utilisant occlusion veineuse pléthysmographie 11,12. Cependant, cette méthode nécessite un cathétérisme de l'artère brachiale, qui est plus invasive que la fièvre aphteuse BA et peut être contre-indiqué chez les patients atteints de néphropathie chronique. Une autre technique pour évaluer la rigidité artérielle est de mesurer la compliance artérielle locale (l'inverse de la raideur) de l'artère carotide, même si ce n'est pas aussi largement utilisé ou validée par des critères cliniques que aPWV 13.
Les patients atteints de néphropathie chronique démontrent à la fois une altération de la fièvre aphteuse BA 14-16 et augmentation de la vitesse des ondes de pulsation aortique aPWV 13,17,18, avant même besoin de dialyse. Il est important d'un point de vue clinique, ces deux mesures non invasives de la dysfonction vasculaire sont des facteurs prédictifs indépendants de futurs événements cardiovasculaires et de mortalité tant chez les patients atteints d'IRC 19-21, ainsi que dans d'autres populations 22-26. Ces techniques peuvent être appliquées à l'étude de différentes populations à risque de maladies cardiovasculaires, y compris les patients atteints de néphropathie chronique.
Les mécanismes exacts par lesquels la dysfonction artérielle se développe en CKD sont encore mal compris; Toutefois, la réduction de l'oxyde nitrique (NO) biodisponibilité est un facteur critique 27-30 et un mécanisme commun de deux EDD facultés affaiblies et l'augmentation de la rigidité artérielle 10,31. Dans CKD, le stress oxydatif est augmenté et contribue à la réduction de la biodisponibilité du NO de 32 à 34. Le stress oxydatif est défini comme la biodisponibilité excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par rapport aux défenses antioxydantes. Stimuli physiologiques, including signalisation inflammatoire, de promouvoir des systèmes d'enzymes antioxydantes pour produire des ROS, y compris l'anion superoxyde (O 2 ● -) (par exemple, l'oxydant enzyme NADPH oxydase.) 35. La production de superoxyde conduit finalement à réduire la biodisponibilité de l'oxyde nitrique (NO).
Avec facultés affaiblies biodisponibilité du NO peut à son tour contribuer au développement de la MRC, comme la dysfonction endothéliale est un facteur prédictif indépendant de l'incident CKD 36. Ceci est cohérent avec les données de l'animal indiquant que l'inhibition de la eNOS induit une hypertension (systémique et glomérulaire), l'ischémie glomérulaire, une glomérulosclérose, et tubulo-interstitielle blessure 37. En effet, réduit la biodisponibilité du NO apparaît nécessaire pour le développement et la progression de la maladie rénale expérimentale qui imite la maladie humaine, suggérant un rôle clé pour la dysfonction endothéliale en CKD humain 38,39.
Marqueurs de stress oxydatif vasculaire peuvent être évalués en vascular cellules endothéliales recueillies auprès de sujets humains de la recherche, en utilisant une technique développée à l'origine par Colombo et al. 40 et modifié Sceaux et al 41-43. Utilisation 2 J-fils stériles, les cellules sont prélevés dans la veine du pli du coude, récupéré, fixe, et, plus tard identifié comme étant des cellules endothéliales et analysés pour l'expression de protéines d'intérêt par immunofluorescence.
Nous fournissons ici une discussion de cette méthode qui peut être utilisée pour une) mesure la fièvre aphteuse BA; b) mesurer aPWV; c) mesurer l'endothélium vasculaire expression de la protéine de la cellule de marqueurs de stress oxydatif. L'accent est mis sur les patients atteints de néphropathie chronique, ne nécessitant pas de dialyse chronique.
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Protocol
Ce protocole est conforme aux directives de la Multiple Institutional Review Board Colorado (COMIRB).
1. Préparation pour la vérification session
- Les participants doivent suivre ces restrictions pour des mesures plus précises: 12 h rapide de la nourriture et de la caféine, 12 h retenue de l'exercice, 12 h retenue de fumer, le cas échéant,> 4 demi-vie retenue de médicaments si possible (peut ne pas être réalisable dans un population tels que les patients CKD), et les femmes en pré-ménopause doivent être testés en jours 1-7 du cycle menstruel afin de minimiser les influences hormonales.
- Préparer 500 ml du tampon de dissociation par addition de 2 ml de 0,5 M d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), 0,05 g d'héparine (180 unités USP / mg), et de 2,5 g d'albumine de sérum bovin à 476,8 ml de tampon phosphate salin (PBS) à pH de 7,4. Ceci peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois.
- Tourner à l'échographie, l'ordinateur et l'hémodynamique non invasiveWorkstation (NIHem; équipement de la rigidité artérielle). Branchez les câbles délivrant des ultrasons à la boîte de déclenchement de l'onde R ordinateur.
2. Collecte et traitement des cellules endothéliales vasculaires
- Une infirmière ou un médecin qualifié effectue la collecte (étapes 2.2 à 2.5, 2.7) et un chercheur recueille et traite les fils (étapes 2.6, 2.8 à 2.19)
- Prep le site du coude avec un antiseptique topique, appliquer un garrot, localiser veine, et Cathétériser avec un 18 G cathéter. Placer un adaptateur heplock sur l'extrémité de la IV.
- Mettez des gants stériles et de mettre des rideaux fenêtrées stériles sur le site.
- Placez 2 J-fils sur les rideaux. Tirez l'arc du "J" pour dérouler la forme de "J" de deux fils.
- Déboucher le heplock et nourrir J-fil dans la veine d'environ 8 cm. Repoussez-et-vient à plusieurs reprises avant de retirer le fil. Évitez sang brut sur le fil.
- Utilisez un coupe-fil pour couper les fils pour qu'ils s'insèrent dans unTube conique de 50 ml contenant ~ 30 ml de tampon de dissociation
- Répétez l'étape 2.5 pour deuxième fil.
- Répétez l'étape 2.6 pour la deuxième fil. Tube de revenir à laboratoire humide.
- Serrer les fils d'une paire de pinces et de maintenir les fils à l'intérieur du tube, mais au-dessus de la solution. Pour 10 min, utiliser un pipetage motorisé de recueillir plusieurs reprises le tampon de dissociation de la 50 ml tube conique et le relâcher pour qu'il fonctionne sur toute la longueur des fils de rincer et faire vibrer les fils, puis secouer l'excès de liquide de fils dans le tube.
- Centrifuger pendant 7 min à 400 g et 4 ° C.
- Préparer la solution de formaldéhyde dans le tube de feuille couverte en combinant 100 ml de solution de formaldéhyde + 900 ml PBS.
- Retirer lentement le tube de la centrifugeuse, tourner sur la pompe à vide, placez un embout de pipette sur la fin de tuyau d'aspiration et de laisser ~ 400 ml dans le tube, passer l'aspirateur hors le reste sans perturber le culot.
- Couvrir de papier aluminium et pipette solution de formaldéhyde de 1 ml dansle tube pour fixer l'échantillon. Ne pas remettre en suspension. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Préparez 8 diapositives par un marquage avec l'objet et de l'information de la visite d'étude et l'élaboration d'un ovale sur chaque diapositive avec un stylo pap.
- Ajouter 15 ml de PBS, remettre les, et centrifuger pendant 5 min à 400 g et 4 ° C.
- Répétez l'étape 2.15, ajouter 12 ml de PBS, remettre les, et centrifuger pendant 6 min à 400 g et 4 ° C.
- Retirer lentement le tube de la centrifugeuse, tourner sur la pompe à vide, placez un embout de pipette sur la fin de tuyau d'aspiration et de laisser ~ 2 ml dans le tube, passer l'aspirateur hors le reste sans perturber le culot.
- Remettre en suspension et pipette de manière uniforme sur les 8 lames dans les zones ovales.
- Place dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 heures puis conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse (échantillons seront bien depuis de nombreuses années).
3. Évaluation de la fièvre aphteuse BA et aPWV
- Avoir un sujet de recherche changement en short jetables et ont him / son mensonge couchée dans une pièce calme, sombre climat contrôlé.
- Placer le nombre approprié de l'ECG pour l'échographie spécifique et le dispositif de la rigidité artérielle (cette procédure utilise l'hémodynamique non invasive Workstation [NIHem] pour mesurer la rigidité artérielle, ce qui nécessite 4 électrodes), et le brassard de pression artérielle sur le sujet.
- Après 20 min, commencer des lectures de pression artérielle. Effectuer au moins 3, et répéter jusqu'à ce que les mesures sont à moins de 5 mmHg, au repos 2 min entre chaque lecture.
- Commencer la tonométrie par la palpation de l'impulsion de l'artère brachiale et de placer le tonomètre d'enregistrer les formes d'onde brachial utilisant le programme de logiciel.
- Répétez l'opération pour les artères radiales, fémorales et carotides.
- Mesurer la distance de chacun de ces sites de l'encoche supersternal l'aide d'un ruban à mesurer (brachiale, radiale et la carotide) et de la règle de mesure / étrier (fémorale).
- Calculer carotide-brachiale, radiale-carotidienne et la carotide-fémorale (aPWV) en utilisant le programme logiciel.
- Lieusang de l'avant-bras la pression du brassard juste en aval de l'olécrâne et enregistrer au moins 10 cycles cardiaques de base artère brachiale images échographiques et des mesures de vitesse d'écoulement du sang, avec un logiciel vasculaire mis en mode déclencher. Un bras mécanique peut être utilisé pour stabiliser la sonde à ultrasons, si désiré.
- Gonflez avant-bras brassard de pression artérielle à 250 mmHg et commencer minuterie. Demandez participant à rester immobile.
- Commencez vitesses d'enregistrement avec un ensemble de logiciels vasculaire en mode déclencher lorsque la minuterie lit 04h45. Trigger libérer le brassard à 05h00 et de changer l'échographie pour enregistrer en mode B (diamètre) des images lorsque l'horloge indique 05h10.
- L'enregistrement jusqu'à l'horloge indique 07h00.
- Marquer au moins 10 cycles cardiaques de base brachial images échographiques de l'artère avec un logiciel vasculaire mis en mode déclencher.
- Prendre la tension artérielle du sujet. Si la pression artérielle systolique> 100 mmHg, placer 0,4 mg de nitroglycérine sublinguale sous le thème &# 39; langue et commencer minuterie, sauf si le patient a une autre contre-indication.
- Commencez l'enregistrement en mode B (images de diamètre) lorsque l'horloge indique 3h00 avec le logiciel vasculaire mis en mode déclencher.
- Arrêter l'enregistrement lorsque l'horloge indique 08h00.
- Surveillance de la pression artérielle jusqu'à ce qu'elle retourne à la ligne de base
4. Préparation de veine ombilicale humaine des cellules endothéliales (HUVEC) lames de contrôle
- Cultivez HUVECs au passage 5-6 et ~ 80% de confluence.
- Trypsiniser avec 3 ml de trypsine ou tout ce qui est nécessaire pour le plat / flacon.
- Neutraliser la trypsine en utilisant un volume égal de solution de neutralisation de la trypsine.
- Centrifuger à 200 g pendant 5 min ~ et enlever la trypsine et la solution de neutralisation par le vide.
- Reprendre dans ~ 10 ml de PBS à laver.
- Centrifuger à 200 xg ~ 5 min. Retirer du PBS.
- Retirer du PBS et fixer en 1800 pl de PBS + 200 pi formaldéhyde.
- Remettre en suspension dans du PBS (~ 10 ml).
- Centrifuger à 200 xg ~5 min. Retirer du PBS, remettre en suspension dans un volume approprié d'ajouter ~ 200 pi par diapositive.
- Stocker les lames à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse (échantillons seront bien depuis de nombreuses années).
5. Coloration des cellules endothéliales vasculaires
- Prenez diapositives de -80 ° C congélateur et attendre 5 min à température ambiante (cette procédure est pour un lot de 10 échantillons, dont un tiroir de commande HUVEC).
- Essuyez l'excès d'eau avec une tâche délicate essuyer (ne pas toucher le centre de la lame).
- Réhydrater les lames en ajoutant modifié PBS à chaque diapositive et les laisser pendant 10 min.
- Alors que les diapositives sont debout, préparer 5% de sérum d'âne et d'autres solutions.
- Préparer un sérum d'âne de 5% par addition de 300 pi de sérum d'âne de 5700 pi de PBS modifié (à un pH de 7,4) pour un maximum de 10 diapositives (augmenter ce montant pour plus).
- Diluer l'anticorps primaire d'intérêt en 1000 ul de 5% de sérum. Par exemple, la nitrotyrosine et NADPHoxydase (1:300 et 1:1500) pourraient être utilisés comme marqueurs de stress oxydatif.
- Préparer AF568 secondaire en diluant 5 ul de AF568 1500 μll de 5% de sérum.
- Préparer VE cadhérine en diluant 2 pi de VE cadhérine à 1000 pi de 5% de sérum.
- Préparer AF488 en diluant 5 ul de VE cadhérine à 1000 pi de 5% de sérum.
- Gardez AF568, VE cadhérine et AF488 sous plastique à travers tout le processus, puis placer sur bascule en 4 ° C réfrigérateur pendant la préparation de diapositives.
- Après 10 minutes de réhydratation, des diapositives secs avec une tâche délicate essuyer.
- Ajouter sérum d'âne de 5% pendant 60 min et placer un morceau de film de paraffine en plastique sur la zone encerclée à assurer une couverture complète de la substance chimique.
- Jeter le film de paraffine plastique et sécher les lames avec une tâche délicate essuyer. Ne pas laver. Ajouter anticorps primaire pendant 60 min et placer un morceau de film de paraffine en plastique sur la zone encerclée à assurerune couverture complète de la substance chimique.
- Jeter le film de paraffine plastique, rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille et laisser tremper dans les colonnes de diapositives pendant 5 min. Alors que les diapositives sont trempage, les déplacer dans une pièce sombre. Travailler dans l'obscurité pour toutes les étapes restantes.
- Diapositives sec avec Kimwipes, ajouter AF568 (anticorps anti secondaire) pendant 45 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
- Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
- Diapositives sec avec Kimwipes, puis ajouter VE cadhérine pendant 60 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
- Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
- Diapositives sec avecune tâche délicate essuyer, ajouter AF488 pendant 30 min et placer un morceau de film plastique de paraffine sur la zone encerclée pour assurer une couverture complète de la substance chimique. Couvrir de la lumière.
- Jeter le film de paraffine plastique dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux. Rincer à l'altération de PBS de gicler bouteille, puis tremper dans les colonnes pendant 5 min.
- Diapositives sec avec une tâche délicate et essuyez permettent lames sécher pendant 20 min. Couvrir de la lumière.
- Ajouter une goutte seulement fluoroshield milieu de montage avec 4 ', le chlorhydrate de 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à chaque diapositive et couvrir chacune avec une lamelle.
- Placez les diapositives dans le 4 ° C réfrigérateur recouvert d'une feuille. Imagerie doit être complété dans les 48 heures.
6. D'imagerie et d'analyse de cellules endothéliales vasculaires
- Préparer microscope pour l'imagerie des cellules endothéliales colorées selon les spécifications du microscope spécifique. Un technicien simple aveugle doit analyser toute protéine particulière pour une chauve-sourisch des cellules.
- Numériser des diapositives systématiquement. Identifier les cellules endothéliales par coloration positive pour VE cadhérine et confirmer l'intégrité nucléaire par coloration positive pour DAPI.
- Image 30 cellules par lame pour une analyse ultérieure. Répétez l'opération pour chaque diapositive dans le lot souillé, y compris la HUVEC.
- Analyser l'intensité de la coloration de l'anticorps primaire d'intérêt en utilisant un logiciel qualitative.
- Pour réduire au minimum possible l'effet de confusion des différences de coloration d'intensité entre les différentes sessions de coloration, des valeurs de rapport comme le rapport de l'expression des protéines dans les cellules endotheliales collectées à la même expression de la protéine dans l'HUVEC.
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Representative Results
FA BA est quantifiée comme la variation maximale de diamètre de l'artère brachiale suivante hyperémie réactive. Ainsi, le diamètre au repos est inférieur au diamètre de la suite de la fin d'une période de 5 min brassard de pression artérielle d'occlusion (figure 1). Le panneau A montre une image échographique représentant de l'artère brachiale, et Groupe B affiche un graphique de l'onde R changement fermée de diamètre de presse brassard à 2 min après, obtenue en utilisant un logiciel disponible dans le commerce. Comme le changement est souvent très minime (figure 1, la variation est de 4,8%), de petites différences dans la mesure peuvent avoir des répercussions importantes sur les résultats. Utilisation d'un logiciel commercial de détection de bord automatisé est fortement recommandé de minimiser les biais et erreurs potentielles dans la mesure 44,45. Comme le stimulus pour la dilatation pendant hyperémie réactive peut différer entre les groupes ou les conditions étant contre, le taux de cisaillement doit être calculé en utilisant le flux sanguin Dopplervitesses, et la fièvre aphteuse BA doivent être ajustées pour les différences lorsque applicables 46,47.
aPWV est calculé avec la participation minimale de l'opérateur par la plupart des systèmes disponibles dans le commerce, y compris la NIHem utilisé dans notre recherche. L'onde R de l'ECG est comparé au "pied" de la forme d'onde sur un site donné, et la différence de temps est calculée (Figure 2) pour l'artère carotide (Panneau A) et l'artère fémorale (partie B). Les mesures de distance sont utilisés en liaison avec les différences de temps pour calculer une vitesse. aPWV on entend une vitesse entre l'artère carotide à l'artère fémorale (c.-à-. long de l'aorte).
l'analyse par immunofluorescence de cellules endothéliales vasculaires cellulaire peut fournir la preuve du niveau de stress oxydatif. Pour tenir compte des différences dans l'intensité de coloration entre les sessions de coloration, le niveau de fluorescence d'une protéine donnée pour chaque sujet (représentant ima ges représentés sur la figure 3, panel A) est comparée à la fluorescence de la coulisse de commande HUVEC (images représentatives illustrées à la figure 3 le panneau B). Ainsi, les différences dans l'expression des protéines peuvent être comparés ou l'autre ou entre les groupes dans les conditions (par exemple, au cours d'une étude d'intervention).
diamètre de l'artère brachiale de base de la figure 1. Représentant obtenu lors de l'évaluation de la dilatation médiée par le flux artère brachiale (FA BA). A) Dans un patient avec une maladie rénale chronique (IRC). B) R-onde changement fermée de diamètre de presse brassard à 2 min suivant est représenté graphiquement, obtenue en utilisant un logiciel disponible dans le commerce.target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Résultats représentatifs d'impression à partir de l'évaluation de aPWV chez un patient à l'IRC. A) Temporisation de l'onde R de l'ECG au pied de l'artère carotide, B) retard de l'onde R de l'ECG au pied de l'artère fémorale (tFoot), recouverte de la forme d'onde de la carotide. Les deux panneaux montrent également les distances entrées de la fourchette sternale aux sites respectifs (représentés par la lettre D; en cm). La valeur aPWV calculé est affiché dans le panneau B (représenté par les lettres VOP, en cm / s). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ P>
Figure 3. Des images représentatifs de l'expression de protéine. A) DAPI (intégrité nucléaire; bleu), VE cadhérine (identification positive des cellules endothéliales; vert) l'oxydant enzyme NADPH oxydase (protéine d'intérêt, rouge) à partir de cellules recueillies à partir d'un patient atteint de maladie rénale chronique B) et d'une cellule veine endothéliale ombilical humain (HUVEC) lame de contrôle.
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Discussion
L'obtention de résultats précis pour la fièvre aphteuse BA et aPWV nécessite l'acquisition d'images ultrasonores de haute qualité et des formes d'ondes de pression, respectivement. Au centre de cette formation est et l'utilisation appropriée et continue de chaque technique par l'opérateur 44. En outre, il est essentiel de contrôler autant de variables externes qui peuvent influer sur les résultats que possible par la standardisation de la session de test (par exemple, avant 12 h rapide, pièce climatisée, etc) 44,45. Comme mentionné ci-dessus, l'utilisation de logiciels d'acquisition fermée dans le commerce de l'onde R et le logiciel de détection de bord est fortement recommandé de minimiser les biais et erreurs potentielles dans la mesure 44,45. Lorsque la fièvre aphteuse BA est altérée, ce qui pourrait être soit en raison d'une déficience libération de NO de l'endothélium ou due à une altération de la réactivité des muscles lisses vasculaires au NO libéré. Nitroglycérine sublinguale est administré à contrôler la réactivité de la lissecouche de cellules de muscle à un donneur d'oxyde nitrique exogène, afin de conclure que toute perte de fièvre aphteuse BA est spécifique à la capacité de l'endothélium vasculaire pour produire de l'oxyde nitrique 44,45.
Comme la mesure est une vitesse, des mesures précises de la distance et du temps sont essentielles. Le protocole que nous avons décrit est basé sur la méthodologie utilisée dans l'étude de Framingham coeur 24. Utilisation d'étriers soulevées plutôt que d'un ruban à mesurer améliore la précision de la mesure de la distance de la fourchette sternale à l'artère fémorale en prenant un chemin direct plutôt que de mesure de potentiel sur l'obésité abdominale. Un "pied" clairement d'un signal propre est absolument nécessaire pour le calcul de la différence de temps entre l'onde R de l'ECG à l'impulsion sur le site de mesure (voir figure 2).
Bien que les techniques de remplacement sont disponibles pour évaluer à la fois la fonction endothéliale et arraideur TÉRIAU, la fièvre aphteuse et BA aPWV sont tous deux couramment utilisé en recherche clinique parce qu'ils sont non-invasive et bien établis que les résultats intermédiaires. En outre, ils sont bien validés dans diverses populations et sont indépendamment prédictif d'événements cardiovasculaires et de mortalité 19-26. Ainsi, ils peuvent être utilisés comme critères de substitution dans les études cliniques évaluant l'efficacité d'une intervention pour réduire le risque cardiovasculaire dans une population donnée, tels que les patients atteints de néphropathie chronique. La modification de ces techniques ne sont pas tenus d'étudier spécifiquement les patients atteints de néphropathie chronique, par rapport à d'autres populations à risque de maladie cardiovasculaire.
Cependant, il ya des limites importantes à la fois de la fièvre aphteuse BA et aPWV que discussion de mérite. FA BA évalue la fonction endothéliale vasculaire d'un grand conduit d'artère (l'artère brachiale), par conséquent, ne fournit pas un indice de la fonction endothéliale microvasculaire. Une technique utilisant séparé occlusion veineuse plethysmgraphie est mieux adapté pour évaluer ce dernier. Cependant, cette méthode nécessite un cathétérisme de l'artère brachiale, qui est plus invasive que la fièvre aphteuse BA et peut être contre-indiqué chez les patients atteints de néphropathie chronique. En outre, la mesure de la fièvre aphteuse BA exige une formation longue et spécifique pour être bien réalisée. aPWV fournit un indice de grande raideur élastique de l'artère, qui peut être différente de la rigidité artérielle locale (comme l'artère carotide). Une autre technique pour évaluer la rigidité artérielle est de mesurer la compliance artérielle locale (l'inverse de la raideur) de l'artère carotide, même si ce n'est pas aussi largement utilisé ou validée par des critères cliniques que aPWV 13. En outre, la contribution de NO comme un déterminant de la rigidité aortique peut varier par lit vasculaire 48. Enfin, il ya des facteurs de confusion potentiels à l'interprétation des deux FA BA et aPWV qui doivent être mesurés et ajustés statistiquement pour, le cas échéant, y compris la ligne de base diameter et taux de cisaillement de la fièvre aphteuse BA 45, et le rythme cardiaque et la pression artérielle pour aPWV 49.
Une considération importante dans la collection de cellules endotheliales vasculaires est la minimisation de sang sur les j-fils et ensuite sur les glissières, de sorte que les cellules endotheliales peuvent être identifiés avec les globules rouges qui se chevauchent dans un minimum d'images. Ceci peut être réalisé avec une formation pour la bonne technique ainsi que le lavage adéquat lors de la récupération des cellules. En analysant les diapositives, il est essentiel que la fluorescence peut être objectivement quantifiée et les images sont claires, sans beaucoup de fond ou de chevauchement avec d'autres cellules. Optimisation des dilutions pour la coloration et la technique d'analyse de microscopie avant l'analyse des échantillons de l'étude sont les principales étapes. Il faut noter que le rendement en cellules de cette technique est d'environ 600 cellules endotheliales vasculaires par la collecte, une quantité insuffisante d'ARNm total sont disponibles pour mesurer l'expression génique, ce qui limite notre sonde à immunoflcoloration uorescente de protéines d'intérêt.
En plus des techniques présentées pour l'évaluation du stress oxydatif vasculaire, ou des marqueurs circulants d'urine peut être utilisée pour évaluer le stress oxydatif 12,50. Cependant, ils peuvent être moins réfléchissante du niveau de stress oxydant spécifique au niveau de l'endothélium vasculaire. L'utilisation de ces marqueurs en combinaison avec les techniques présentées peut fournir la meilleure indication du niveau global de stress oxydatif.
Nous avons fourni un aperçu des méthodes qui peuvent être utilisées pour mesurer la fièvre aphteuse BA, aPWV, et l'endothélium vasculaire expression de la protéine de la cellule. Ces techniques sont appropriés non seulement pour les patients atteints de néphropathie chronique, mais aussi dans d'autres populations à risque accru de maladie cardiovasculaire. Ensemble, ils donnent un aperçu de la dysfonction vasculaire endothéliale, grande rigidité de l'artère élastique, et de contribuer mécanismes physiologiques, y compris le stress oxydatif.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Nina Bispham pour son aide technique. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (12POST11920023), et le NIH (K23DK088833, K23DK087859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
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