Summary
혈관 장애 및 생리 학적 기전에 기여하는 정도는 상완 동맥 흐름 중재 팽창 대동맥 맥파 속도, 혈관 내피 세포의 단백질 발현을 측정함으로써, 만성 신장 질환을 가진 환자에서 평가 될 수있다.
Abstract
만성 신장 질환 (CKD) 환자는 크게 일반 인구에 비해 심혈관 질환 (CVD)의 위험이 증가하고,이 부분적으로 만 기존의 CVD 위험 요인에 의해 설명된다. 혈관 장애는 혈관 내피 기능 장애 (가장 일반적으로 장애인 내피 세포에 의존하는 팽창 [EDD]로 평가)과 큰 탄성 동맥의 경직을 특징으로 중요한 비 전통적인 위험 요소입니다. 다양한 기술이 EDD 큰 탄성 동맥 강성을 평가하기 위해 존재하지만 가장 일반적으로 각각 상완 동맥 흐름 중재 팽창 (FMD의 BA)와 대동맥 맥파 속도 (대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적가) 있습니다 사용. 혈관 장애의 이러한 비 침습적 측정 모두와 신장 질환이없는 환자에서 미래의 심혈관 질환의 독립적 인 예측 인자이다. CKD 환자는 모두 장애인 FMD BA을 설명하고, 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 증가했다. 반면에 의한 정확한 메커니즘 혈관 부전 deve을CKD에서의 해양 생물이 불완전하게 이해하고, 증가 된 산화 스트레스 및 산화 질소 (NO) 생체 이용률의 후속 감소는 중요한 기여자이다. 산화 스트레스의 세포 변화는 전주 정맥 혈관 내피 세포를 수집하고 면역을 사용하여 산화 스트레스의 마커 단백질 발현을 측정하여 평가 될 수있다. 우리는 FMD BA, 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적, 혈관 내피 세포의 단백질 발현을 측정하기 위해 여기에이 방법에 대한 설명을 제공한다.
Introduction
만성 신장 질환 (CKD)는 단독 1 미국에서 ~ 인구의 11.5 %에 영향을 미치는 전염병 비율에 도달하였습니다 주요 공중 보건 관심사입니다. CKD 환자에서 심혈관 사망 또는 심장 혈관 사건의 위험은 크게 일반 인구의 2 ~ 4에 비해 증가한다. CKD 환자는 기존의 심장 혈관 위험 요소의 높은 유병률을 나타내고 있지만, 이것은 단지 심혈관 질환의 자신의 발생률이 증가 (CVD) 5의 일부를 설명합니다. 혈관 장애는 신장 6-9의 분야에서 증가 인정 받고 중요한 비 전통적인 심혈관 질환의 위험 요인이다.
많은 변화 가능성 동맥 부전의 발전에 기여하는 반면, 큰 관심사들 사이에서 가장 일반적으로 손상된 내피 의존성 팽창 (EDD)로 평가 혈관 내피 기능 장애의 발달, 그리고 LA의 경직 아르RGE 탄성 동맥 10. 다양한 기술 및 EDD 큰 탄성 동맥 경화를 평가하기 위해 존재하지만, 가장 일반적으로 사용되는 각각 상완 동맥 흐름 중재 팽창 FMD BA 및 대동맥 맥파 속도 (대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적)이다. EDD을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 기술은 정맥 폐색 혈량 측정법 (plethysmography) (11, 12)을 사용하여 아세틸 콜린 등의 약물 에이전트에 팔 혈류 반응을 측정한다. 그러나,이 방법은 FMD BA보다 더 많은 침략과 CKD 환자에서 금기 할 수있다 상완 동맥의 도관이 필요합니다. 동맥 경화를 평가하기 위해 대체 기술이 널리 이용되거나 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적으로 21 임상 종점으로 확인되지 않지만, 경동맥 동맥 로컬 컴플라이언스 (강성의 역수)를 측정하는 것이다.
CKD 환자는 손상 한 FMD BA 14-16 증가 대동맥 맥파 속도 AP를 모두 보여웨스트 버지니아 13,17,18도 전에 투석을 필요로합니다. 중요한 임상 적 관점에서, 혈관 기능 장애의 이러한 비 침습적 조치 모두 CKD 19-21뿐만 아니라 다른 인구 22 ~ 26의 환자에서 모두 미래의 심혈관 사건과 사망률의 독립적 인 예측 인자이다. 이 기술은 CKD 환자 등의 CVD 위험이 다양한 인구를 공부에 적용 할 수 있습니다.
동맥 부전 CKD에서 개발하는 정확한 메커니즘은 불완전하게 이해된다; 그러나, 감소 된 산화 질소 (NO) 생체 이용률은 중요한 기여를 27-30과 장애인 EDD 모두의 일반적인 메커니즘 증가 동맥 경화 10,31입니다. CKD에서, 산화 스트레스가 증가하고, NO 생체 이용률 32-34의 감소에 기여한다. 산화 스트레스는 항산화 방어에 상대적인 반응성 산소 종 (ROS)의 과다 생물학적으로 정의된다. 생리적 인 자극, INC염증 신호를 건의 Luding, 산화 효소 시스템을 촉진 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 ● -)를 포함하여, ROS를 생산하는 (예를 들면, 산화 효소 NADPH 산화 효소.) 35. 슈퍼 옥사이드의 생산은 궁극적으로 산화 질소 (NO)의 생체 이용률을 감소로 연결됩니다.
내피 기능 장애는 사건의 CKD (36)의 독립적 인 예측대로 손상 NO 생체 이용률은 차례로, CKD의 발전에 기여할 수 없다. 이 동물 데이터 eNOS의 억제는 고혈압 (전신 및 사구체)를 유도하는 것을 나타내는과 일치, 사구체 국소 빈혈, 사구체 경화증 및 tubulo 간질 부상 37. 실제로, NO 생체 이용률이 인간의 CKD (38, 39)의 내피 기능 장애에 대한 중요한 역할을 제안, 인간의 질병을 모방 실험 신장 질환의 개발과 진행에 필요한 나타납니다 감소.
혈관 산화 스트레스의 마커는 V에서 평가 될 수있다원래 콜롬보 등. (40)에 의해 개발 및 씰 등 41-43 수정 기술을 사용하여, 인간의 연구 대상에서 수집 내피 세포를 ascular. 2 멸균 J-선을 사용하여, 세포가 전주 정맥에서 수집, 복구 고정하고, 나중에 긍정적으로 내피 세포로 확인하고 면역을 사용하여 관심의 단백질의 발현을 분석 하였다.
우리는 여기에) 측정 FMD의 BA에 사용할 수있는이 방법에 대한 설명을 제공한다; b)는 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 측정; C) 산화 스트레스의 마커의 혈관 내피 세포의 단백질 발현을 측정합니다. 초점은 만성 투석을 필요로하지 않는, CKD 환자에 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 콜로라도 여러 기관 검토위원회 (COMIRB)의 지침을 따릅니다.
테스트 세션 1. 준비
- 참가자가 가장 정확한 측정을 위해 이러한 제한을 따라야합니다 : 음식과 카페인 빠른 12 시간을, 운동, 흡연 12 시간의 구속에서 12 시간의 억제는 약물의 적용> 4 반감기 억제는 가능하면 (에 가능하지 않을 수 있습니다 경우 이러한 CKD 환자와 같은 인구), 그리고 폐경 전 여성이 일 호르몬의 영향을 최소화하기 위해 월경주기의 1-7에서 테스트해야합니다.
- 인산 완충 식염수 (PBS)의 476.8 ml로에 2 ㎖ M 0.5의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 헤파린 (180 USP 단위 / mg)을 0.05 g, 및 소 혈청 알부민 2.5 g을 첨가하여 해리 완충액 500 ㎖를 준비 7.4의 산도. 이것은 몇 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 초음파, 컴퓨터 및 비 침습성 혈역학을 켭니다워크 스테이션 (NIHem, 동맥 강성 장비). 컴퓨터 R-파 트리거 박스에 초음파를 출력 케이블을 연결합니다.
혈관 내피 세포의 2. 수집 및 처리
- 훈련을받은 간호사 또는 의사는 수집을 수행 (2.2-2.5, 2.7 단계) 및 연구원 와이어를 수집하고 처리 (2.6, 2.8-2.19 단계)
- , 국소 소독제와 전주 사이트를 예비 학교에 지혈대를 적용, 정맥 찾은 18 G 카테터와 cannulate. IV의 끝에 heplock 어댑터를 놓습니다.
- 멸균 장갑을 착용하고 사이트를 통해 불임의 fenestration 있음을 넣어.
- 커튼에 2 J-선을 배치합니다. 두 전선에서 "J"모양을 풀다하는 "J"의 아크를 당깁니다.
- heplock를 덮개를 벗기다 및 정맥 약 8cm로 J-와이어를 공급. 와이어를 제거하기 전에 앞뒤로 여러 번 누릅니다. 와이어에 심한 혈액을 피하십시오.
- 그들이에 들어갈 수 있도록 전선을 싹둑 전선 절단기를 사용하여해리 버퍼 ~ 30 ㎖를 포함하는 50 ML 원뿔 관
- 두 번째 와이어 2.5 단계를 반복합니다.
- 두 번째 와이어 단계 2.6를 반복합니다. 젖은 실험실에 튜브를 반환합니다.
- 포셉 한 쌍의 전선을 걸쇠와 관의 내부에 전선을 보유하지만, 상기 용액. 10 분 동안 반복해서 50 ML 원뿔 튜브에서 분리 버퍼를 수집하는 전동 피펫을 사용하고 관에 전선에서 과잉 유동성을 흔들어 다음, 전선을 씻어 진동하는 전선의 길이를 아래로 실행되도록 놓습니다.
- 400 XG에 7 분, 4 ℃에서 원심 분리
- 100 ml의 포름 알데히드 용액 + 900 ㎖의 PBS를 결합하여 호일 커버 튜브에 포름 알데히드 용액을 준비합니다.
- 천천히, 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 진공 펌프를 켭니다, 흡입 호스의 끝 부분에 피펫 팁을 배치하고 펠렛을 방해하지 않고 나머지를 진공 청소기로 청소, 튜브 ~ 400 ㎖에 둡니다.
- 박 및 피펫 1 ㎖ 포름 알데히드 용액에 커버샘플을 해결하기 위해 관. 재현 탁하지 마십시오. 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 제목과 연구 방문 정보 표시와 아빠 펜으로 각각의 슬라이드에 타원을 그려 8 슬라이드를 준비합니다.
- 15 ML 400 XG에서 5 분, 4 ° C.에 대한 PBS,에 resuspend, 원심 분리기 추가
- 단계를 반복 2.15, 12 ML 400 XG에 6 분 4 ° C.에 대한 PBS,에 resuspend, 원심 분리기를 추가
- 천천히, 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 진공 펌프를 켭니다, 흡입 호스의 끝 부분에 피펫 팁을 배치하고 펠렛을 방해하지 않고 나머지를 진공 청소기로 청소, 튜브 ~ 2 ㎖를 둡니다.
- 균등하게 타원형 지역에있는 8 슬라이드에서 재현 탁 피펫.
- 5 시간 동안 37 ° C에서 다음 (샘플이 몇 년 동안 잘 될 것입니다) 분석을위한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 보관 인큐베이터에있는 장소.
FMD BA와 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 3. 평가
- 일회용 팬티에 대한 연구 제목 변경을하고 시간이조용하고, 희미한, 기후 제어 방에서 메신저 / 그녀의 거짓말 부정사.
- 해당 특정 초음파 및 동맥 경화 장치에 대한 ECG의 수 (이 절차는 비 침습성 혈역학 워크 스테이션 [NIHem] 4 전극을 필요로 동맥 강성을 측정하는 데 사용), 그리고 주제에 혈압 커프를 놓습니다.
- 20 분 후, 혈압 판독을 시작한다. 적어도 3을 수행하고 측정이 5 mmHg로 내 때까지 각 읽기 사이에 2 분 휴식, 반복합니다.
- 상완 동맥의 맥박에 대한 부위를 촉진 및 소프트웨어 프로그램을 사용하여 상완 파형을 기록 안압계를 배치하여 안압계를 시작한다.
- , 반경 대퇴 및 경동맥에 대해 반복합니다.
- 줄자 (상완 요골과 경동맥) 및 사용자 정의 자 / 캘리퍼스 (대퇴골)를 사용하여 supersternal 노치에서 각 사이트까지의 거리를 측정한다.
- 소프트웨어 프로그램을 사용하여 경동맥, 상완, 경동맥 레이디 얼, 경동맥 - 대퇴 (대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적)를 계산합니다.
- 장소모드를 트리거하도록 설정 혈관 소프트웨어 주두 처리 및 기록 기준선 상완 동맥 초음파 영상 및 혈액 유속 측정의 적어도 10 심장 사이클 바로 원위 팔뚝 혈압 커프. 기계 팔 원한다면 초음파 프로브를 견고하게하기 위해 사용될 수있다.
- 250 mmHg로에 팔 혈압 커프를 팽창시키고 타이머를 시작합니다. 매우 여전히 남아있는 참가자를 지시합니다.
- 타이머 4:45을 읽을 때 모드를 실행하기 위해 혈관 소프트웨어 세트와 기록 속도를 시작합니다. 트리거는 5시에 커프를 해제하고 시계는 5:10 읽을 때 B-모드 (직경) 이미지를 기록하는 초음파를 변경합니다.
- 시계가 7시 될 때까지 녹음을 계속합니다.
- 모드를 실행하도록 설정 혈관 소프트웨어를 기본 상완 동맥 초음파 영상의 기록을 최소 10 심장주기.
- 피사체의 혈압을 가라. 만약 수축기 혈압> 100 mmHg로, 다 제목하에 설하 니트로 글리세린 0.4 mg의 배치 및# 39;의 혀와 환자가 다른 금기 사항이 없으면, 타이머를 시작합니다.
- 시계 모드를 실행하도록 설정 혈관 소프트웨어와 3시 읽을 때 B-모드 (직경 이미지) 기록을 시작합니다.
- 시계는 8:00 읽을 때 녹음을 중지합니다.
- 이 기준에 반환 될 때까지 혈압을 모니터
4. 인간 제대 정맥 내피 세포를 준비 (HUVEC) 제어 슬라이드
- 통로 5-6 된 HUVEC 성장과 ~ 80 %의 포화 상태.
- 3 트립신의 ML 또는 어떤 요리 / 플라스크에 필요한과를 Trypsinize.
- 트립신 중화 용액 동량을 사용하여 트립신을 중화.
- ~ 5 분 200 XG에 원심 분리기와 진공 청소기를 이용하여 트립신과 중화 솔루션을 제거합니다.
- 씻어 ~ 10 ㎖의 PBS를에 재현 탁.
- 200 XG ~ 5 분 원심 분리기. PBS를 제거합니다.
- PBS를 제거하고 1800 μL PBS + 200 ㎕의 포름 알데히드에 고정합니다.
- PBS (~ 10 ml)에 재현 탁.
- ~ 200 XG에 원심 분리기5 분. 슬라이드 당 ~ 200 μl를 추가 할 수있는 적절한 볼륨 PBS,에 resuspend를 제거합니다.
- -80 ° C에서 보관 슬라이드 분석을위한 준비가 될 때까지 (샘플 몇 년 동안 잘 될 것입니다).
혈관 내피 세포의 5. 염색
- -80 ° C의 냉장고에서 슬라이드를 타고 (이 절차는 한 HUVEC 제어 슬라이드를 포함, 10 슬라이드의 배치입니다) 실온에서 5 분을 기다립니다.
- 섬세한 작업 와이프 (슬라이드의 중앙을 터치하지 않음)을 가진 과잉의 물을 닦아.
- 각 슬라이드에 변경 PBS를 추가하여 슬라이드를 다시하는 것은 수화물 10 분을 둡니다.
- 슬라이드 서있는 동안, 5 % 당나귀 혈청 및 기타 솔루션을 준비합니다.
- 최대 10 개의 슬라이드를 위해 (7.4의 pH로) 변경된 PBS의 5,700 μL에 당나귀 혈청 300 μl를 추가하여 5 % 당나귀 혈청을 준비한다 (더이 양을 증가).
- 5 % 혈청의 1,000 μL에 대한 관심의 기본 항체를 희석. 예를 들어, nitrotyrosine와 NADPH를 위해산화 효소 (1:300과 1:1,500)는 산화 스트레스의 지표로 사용할 수 있습니다.
- 5 % 혈청 1500 μll에 AF568의 5 μl를 희석하여 보조 AF568를 준비합니다.
- 준비의 2 μl를 희석하여 cadherin의 VE 5 % 혈청의 1,000 μL에 카데 린을 VE.
- 5 μl를 희석하여 AF488 준비는 5 % 혈청의 1,000 μL에 카데 린을 VE.
- AF568를 유지, 전체 과정을 통해 포일에서 헤린과 AF488 VE와 슬라이드를 준비하는 동안 다음 4 ° C 냉장고에 로커에 배치합니다.
- 재수의 10 분 후, 섬세한 작업 건조 슬라이드를 닦아냅니다.
- 60 분 동안 5 % 당나귀 혈청을 추가하고 화학 물질의 완전한 범위를 보장하기 위해 원으로 지역에 플라스틱 파라핀 필름의 조각을 배치합니다.
- 섬세한 작업과 플라스틱 파라핀 필름 건조 슬라이드를 폐기 닦아냅니다. 세척하지 마십시오. 60 분 동안 차 항체를 추가하고 보장하기 위해 원으로 지역에 플라스틱 파라핀 필름의 조각을 배치화학 물질의 전체 범위.
- 물총 병에서 변형 된 PBS로 세척하고 5 분 동안 슬라이드 열의 흡수, 플라스틱 파라핀 필름을 폐기하십시오. 슬라이드를 적시는 동안, 어두운 방으로 이동합니다. 나머지 모든 단계에 대한 어둠 속에서 작업 할 수 있습니다.
- 킴 와이프 건조 슬라이드, 45 분 AF568 (차 항체)를 추가하고, 화학 물질의 완전한 범위를 보장하기 위해 원으로 지역에 플라스틱 파라핀 필름의 조각을 배치합니다. 빛에서 커버.
- 생물 학적 폐기물 용기의 플라스틱 파라핀 필름을 폐기하십시오. 물총 병에서 변경된 PBS와 린스, 다음 5 분 동안 열을 담가.
- 킴 와이프 건조 슬라이드, 다음, 추가 60 분 cadherin의를 VE 및 화학 물질의 완전한 범위를 보장하기 위해 원으로 지역에 플라스틱 파라핀 필름의 조각을 배치합니다. 빛에서 커버.
- 생물 학적 폐기물 용기의 플라스틱 파라핀 필름을 폐기하십시오. 물총 병에서 변경된 PBS와 린스, 다음 5 분 동안 열을 담가.
- 건조 슬라이드섬세한 작업은 30 분 AF488를 추가하고 화학 물질의 완전한 범위를 보장하기 위해 원으로 지역에 플라스틱 파라핀 필름의 조각을 배치 닦아냅니다. 빛에서 커버.
- 생물 학적 폐기물 용기의 플라스틱 파라핀 필름을 폐기하십시오. 물총 병에서 변경된 PBS와 린스, 다음 5 분 동안 열을 담가.
- 섬세한 작업을 건조 슬라이드를 닦아 슬라이드를 20 분 동안 건조 할 수 있습니다. 빛에서 커버.
- 각 슬라이드에 4 매체를 장착 만 fluoroshield 한 방울 ', 6 diamidino -2 - 페닐 인돌 염산염 (DAPI)을 추가하고 커버 슬립 각을 커버합니다.
- 호일로 덮여 4 ° C 냉장고에 슬라이드를 놓습니다. 영상은 48 시간 이내에 완료해야합니다.
6. 이미징 및 혈관 내피 세포의 분석
- 특정 현미경의 사양에 따라 스테인드 내피 세포 이미징을위한 현미경을 준비합니다. 하나의 눈을 멀게 기술자는 박쥐에 특정 단백질을 분석해야세포의 채널.
- 체계적으로 슬라이드를 검사합니다. cadherin의를 VE 및 DAPI에 대한 긍정적 인 염색으로 핵 완전성을 확인하기 위해 긍정적 인 염색에 의해 내피 세포를 식별합니다.
- 나중에 분석을위한 슬라이드 당 이미지 30 세포. HUVEC을 포함, 스테인드 일괄 처리의 각 슬라이드에 대해 반복합니다.
- 질적 인 소프트웨어를 사용하여 그 차 항체에 대한 염색의 강도를 분석합니다.
- 다른 염색 세션, HUVEC에서 동일한 단백질 발현에 수집 된 내피 세포에있는 단백질 발현의 비율로보고 값 사이의 강도 염색의 차이 가능한 혼란 효과를 최소화하기 위해.
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Representative Results
FMD BA 반응성 충혈 다음 상완 동맥의 직경 피크 변화로 정량화된다. 따라서, 나머지의 직경은 5 분의 혈압 수갑을 폐쇄 기간 (그림 1)의 끝에 다음과 같은 직경과 비교된다. 패널은 상완 동맥의 대표적인 초음파 영상을 보여주고, 상용 소프트웨어를 사용하여 얻은 패널 B는 다음 2 분에 팔 릴리스에서 직경 R-웨이브 게이트 변화의 그래프를 표시합니다. 변화는 (그림 1의 변화가 4.8 %이다)는 종종 아주 최소한으로, 측정의 작은 차이가 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 자동 에지 검출 소프트웨어의 사용은 높은 측정 44, 45의 편견과 오류 가능성을 최소화하는 것이 좋습니다. 반응성 충혈 동안 팽창에 대한 자극이 그룹 또는 비교되는 조건에 따라 상이 할 수 있음으로, 전단 속도는 도플러 혈류를 이용하여 계산되어야속도 및 FMD BA는 46, 47 적용의 차이를 조정해야합니다.
대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적는 우리의 연구에 사용 된 NIHem을 포함한 대부분의 상용 시스템에 의해 최소한의 운전자 입력으로 계산됩니다. ECG의 R-파가 관련 사이트에서 파형의 "다리"와 비교 된 시차는 경동맥 (패널 A)과 대퇴 동맥 (패널 B)에 대해 (도 2)을 산출한다. 거리 측정은 속도를 계산하는 시간 차이와 함께 사용된다. 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 (예. 대동맥을 따라) 대퇴 동맥 경동맥 사이의 속도를 의미한다.
혈관 내피 세포의 면역 형광 분석은 산화 적 스트레스의 수준의 셀룰러 증거를 제공 할 수있다. 염색 세션 사이의 염색 강도의 차이를 설명하기 위해, 각각의 주제 (대표 IMA에 대한 특정 단백질의 형광의 수준 그림 3 패널 A)에 도시 릿지는 HUVEC 제어 슬라이드 (대표 이미지는 그림 3 패널 B에 도시)의 형광과 비교된다. 따라서, 단백질 발현의 차이는 (개입 연구 기간 동안, 예를 들면) 그룹간에 또는 조건에 걸쳐 하나를 비교할 수 있습니다.
상완 동맥 흐름 중재 팽창 (FMD의 BA)의 평가 과정에서 얻은 그림 1. 대표 기준 상완 동맥의 직경. 상용 소프트웨어를 사용하여 얻은 A) 만성 신장 질환 (CKD)을 가진 환자에서. 다음 2 분에 팔 릴리스 직경 B) R-웨이브 게이트 변화를 그래픽으로 표시됩니다.대상 = "_blank"는>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CKD를 가진 환자에서 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적으로 평가에서 그림 2. 대표 결과 인쇄 아웃. A) 경동맥의 다리에 ECG의 R 파에서 시간 지연, 대퇴 동맥 (TFOOT)의 다리에 ECG의 R 파에서 B) 시간 지연, 경동맥 파형으로 입혔다. 두 패널은 각각의 사이트에 suprasternal 노치에서 입력 된 거리 표시 (문자 D로 표시를, CM에서). 계산 된 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 값은 패널 B에 표시됩니다 (문자 PWV로 표현; cm / 초에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>
그림 3. 단백질 발현의 대표 이미지. A) DAPI (핵 무결성, 블루), 긍정적 인 내피 세포의 식별 (카데 린을 VE, CKD의 B를 가진 환자에서 수집 한 세포)로부터 인간 제대 정맥 내피 세포 빨간색), 녹색) 산화 효소 NADPH 산화 효소 그 (단백질 (HUVEC) 제어 슬라이드.
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Discussion
FMD BA 및 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적에 대한 정확한 결과를 얻기 각각 높은 품질의 초음파 영상 및 압력 파형을 획득해야합니다. 이 핵심은 운영자 (44)에 의해 각 기술의 적절하고 지속적인 교육 및 사용하는 것입니다. 또, 테스트 세션 (예를 들면, 이전 12 시간 단식, 온도 조절 실 등) (44,45)를 표준화하여 가능한 결과에 영향을 미칠 수만큼 외부 변수에 대한 제어가 중요하다. 위에서 언급 한 바와 같이, 상업적으로 R-웨이브 게이트 수집 소프트웨어 및 에지 감지 소프트웨어의 사용은 높은 측정 44, 45의 편견과 오류 가능성을 최소화하는 것이 좋습니다. FMD의 BA가 손상되면, 이는 내피 세포로부터 방출을 손상하지 또는 인해 NO 출시 혈관 평활근의 장애 대응으로 하나가 될 수 있습니다. 설하 니트로 글리세린은 부드러운의 응답에 대한 제어 관리합니다FMD BA에 어떤 손상이 산화 질소 44, 45를 생산하는 혈관 내피 세포의 기능에 고유 한 결론하기 위해 외인성 산화 질소 공여체에 근육 세포 층.
측정 속도이기 때문에, 거리와 시간의 정확한 측정이 중요하다. 우리가 기술 한 프로토콜은 Framingham 심장 연구 (24)에 사용 된 방법론을 기반으로합니다. 오히려 줄자보다 상승 캘리퍼스의 사용은 오히려 복부 비만에 잠재적 인 측정보다 직접 경로를 복용하여 대퇴 동맥에 suprasternal 노치에서 거리 측정의 정확성을 향상시킵니다. 깨끗한 파형의 클리어 "다리"는 측정 부위에서 임펄스 (도 2 참조)으로 ECG의 R-파의 시간 차이의 계산을 위해 절대적으로 필요하다.
다른 기술은 내피 기능과 ar을 모두 평가하는 데 사용할 수 있지만그들은 비 침습적이며, 잘 중간 결과로 설립 때문에 terial 강성, FMD BA와 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적는 일반적으로 임상 연구에 사용되는 두 수 있습니다. 또한, 그들은 잘 다양한 인구에 걸쳐 검증 및 심혈관 질환과 사망률의 19-26의 독립적 예측되어 있습니다. 따라서, 그런 CKD 환자로서, 주어진 집단에서 심혈관 위험을 줄이기 위해 개입 효능을 평가하는 임상 연구에서 대리 엔드 포인트로서 사용될 수있다. CVD의 위험이 다른 집단에 비해 이러한 기술의 수정은, 특히 CKD 환자를 연구 할 필요가 없습니다.
그러나, FMD BA 및 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 그 공로 토론 모두에 중요한 제한이 있습니다. FMD BA 따라서 미세 혈관 내피 세포 기능의 지표를 제공하지 않습니다, 큰 도관 동맥 (상완 동맥)의 혈관 내피 세포 기능을 평가합니다. 정맥 폐색 plethysm를 사용하여 별도의 기술ography 후자를 평가하기에 더 적합합니다. 그러나,이 방법은 FMD BA보다 더 많은 침략과 CKD 환자에서 금기 할 수있다 상완 동맥의 도관이 필요합니다. 또한, FMD BA의 측정이 잘 수행하기 위해 긴 특정 훈련을 필요로합니다. 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 (예 : 경동맥 등) 지역의 동맥 경화와 다를 수 있습니다 큰 탄성 동맥 경화의 지표를 제공한다. 동맥 경화를 평가하기 위해 대체 기술이 널리 이용되거나 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적으로 21 임상 종점으로 확인되지 않지만, 경동맥 동맥 로컬 컴플라이언스 (강성의 역수)를 측정하는 것이다. 또한, 대동맥 강성의 결정으로 NO의 기여는 혈관 침대 (48)에 의해 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 기준 D를 포함하여 적절하게 측정하고 통계적으로 조절 될 필요가 FMD BA와 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 모두의 해석에 혼동 가능성이있다iameter 및 전단 FMD BA 45 속도, 심박수 및 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 49 혈압.
혈관 내피 세포의 컬렉션의 중요한 고려 사항은 내피 세포 이미지의 중복을 최소화 적혈구 식별 할 수 있도록, J-선에 혈액을 최소화하고 이후에 슬라이드됩니다. 세포를 회수 할 때 적절한 기술 훈련뿐만 아니라 충분한 세척을 달성 할 수있다. 슬라이드를 분석 할 때 형광이 객관적으로 정량화 할 수 있고, 이미지를 다른 세포와 많은 배경 또는 오버랩없이 명확하다는 것이 중요하다. 이전의 연구 샘플의 분석을 염색하고 현미경 분석 기술에 대한 희석의 최적화는 중요한 단계입니다. 참고로,이 기술의 셀 수율은 ~ 모음 600 혈관 내피 세포는 전체의 mRNA의 양이 부족하여 immunofl하기 위해 프로브를 제한, 유전자 발현을 측정하는 데 사용할 수 있습니다관심의 단백질의 uorescent 염색.
혈관 산화 스트레스를 평가 순환 또는 소변 마커 제시된 기법 이외에 산화 스트레스 12,50을 평가하기 위해 사용될 수있다. 그러나 이러한 혈관 내피 세포의 레벨에 특정한 산화 스트레스의 레벨 이하의 반사 형일 수있다. 제시된 기법과 함께 이러한 마커를 사용하여 산화 스트레스의 전반적인 레벨의 최상의 표시를 제공 할 수있다.
우리는 FMD BA, 대동맥 맥파 속도를 통하여 간접적 및 혈관 내피 세포의 단백질 발현을 측정하는데 사용될 수있는 방법에 대한 개요를 제공했다. 이 기술은 CKD 환자에 대한뿐만 아니라 적절한뿐만 아니라 심혈관 질환의 위험이 높은 다른 집단에 있습니다. 공동으로, 그들은 혈관 내피 기능 장애, 큰 탄성 동맥 경화, 및 산화 스트레스 등의 생리 학적 메커니즘을, 기여에 대한 통찰력을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 기술 지원을 니나 프레스톤 감사합니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (12POST11920023)와 NIH (K23DK088833, K23DK087859)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
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