Vurdering av vaskulær funksjon hos pasienter med kronisk nyresykdom

Summary

Graden av vaskulær dysfunksjon og bidra fysiologiske mekanismer kan vurderes hos pasienter med kronisk nyresykdom ved å måle brakialarterie flow-mediert dilatasjon, aortic pulsbølgehastighet, og vaskulær endotelceller protein uttrykk.

Abstract

Pasienter med kronisk nyresykdom (CKD) har betydelig økt risiko for kardiovaskulær sykdom (CVD) sammenlignet med den generelle befolkningen, og dette er bare delvis forklares med tradisjonelle CVD risikofaktorer. Vaskulær dysfunksjon er et viktig ikke-tradisjonell risikofaktor, preget av vaskulær endotelial dysfunksjon (oftest bedømt som påvirket endotelet-avhengig dilatasjon [EDD]) og stivne av store elastiske arterier. Mens ulike teknikker eksisterer for å vurdere EDD og stor elastisk arterie stivhet, den mest brukte er brakialarterie flow-mediert dilatasjon (FMD _BA) og aorta puls-bølgehastighet (aPWV), henholdsvis. Begge disse invasiv tiltak av vaskulær dysfunksjon er uavhengige prediktorer for fremtidige kardiovaskulære hendelser hos pasienter med og uten nyresykdom. Pasienter med CKD demonstrere både svekket FMD _BA, og økt aPWV. Mens de nøyaktige mekanismene som vaskulær dysfunksjon utviklops i CKD er ufullstendig forstått, økt oksidativt stress, og en etterfølgende reduksjon av nitrogenoksid (NO) Biotilgjengelighet er en viktig bidragsyter. Celleforandringer i oksidativt stress kan vurderes ved å samle vaskulære endotelceller fra antecubital blodåre og måle protein uttrykk for markører for oksidativt stress ved hjelp av immunfluorescens. Vi gir her en diskusjon av disse metodene for å måle FMD _BA, aPWV, og vaskulær endotelceller protein uttrykk.

Introduction

Kronisk nyresykdom (CKD) er et stort folkehelseproblem som har nådd epidemiske proporsjoner, påvirker ~ 11,5% av befolkningen i USA alene ^en. Risikoen for kardiovaskulær død eller en kardiovaskulær hendelse hos pasienter med CKD er betydelig økt sammenlignet med den generelle befolkningen ^2-4. Selv om pasienter med CKD utviser en høy forekomst av tradisjonelle kardiovaskulære risikofaktorer, bare forklarer denne delen av deres økt forekomst av hjerte-og karsykdommer (CVD) ^5. Vaskulær dysfunksjon er en viktig utradisjonell kardiovaskulær risikofaktor få økt anerkjennelse innen nefrologi ^6-9.

Mens mange endringer sannsynligvis bidrar til utvikling av arterielt dysfunksjon, blant de av størst interesse, er utviklingen av vaskulær endotelial dysfunksjon, oftest bedømt som påvirket endotelium-avhengige dilatasjon (EDD), og stivne i den large elastiske arterier ^10. Ulike teknikker eksisterer for å vurdere EDD og stor elastisk arterie stivhet, men den mest brukte er brakialarterie flow-mediert dilatasjon FMD _BA og aorta puls-bølgehastighet (aPWV), henholdsvis. En annen mye brukt teknikk for å vurdere EDD er å måle underarm blodstrøm respons på farmakologiske midler som acetylkolin ved hjelp av venøs okklusjon plethysmography ^11,12. Men denne metoden krever kateterisering av brachialis arterien, som er mer invasive enn FMD _BA og kan være kontraindisert hos pasienter med CKD. En alternativ teknikk for å vurdere arteriell stivhet er å måle den lokale arteriell compliance (den inverse av stivhet) av halspulsåren, selv om dette ikke er så mye brukt eller validert med kliniske endepunkter som aPWV ^13.

Pasienter med CKD demonstrere både nedsatt FMD _BA ^14-16 og økt aortic pulsbølgehastighet aPWV ^13,17,18, selv før du trenger dialyse. Viktigere fra et klinisk perspektiv, begge disse invasiv tiltak av vaskulær dysfunksjon er uavhengige prediktorer for fremtidige kardiovaskulære hendelser og mortalitet både hos pasienter med CKD ^19-21, så vel som i andre populasjoner ^22-26. Disse teknikkene kan brukes til å studere ulike populasjoner i fare for hjerte-og karsykdom, herunder pasienter med CKD.

De eksakte mekanismene som arteriell dysfunksjon utvikler i CKD er ufullstendig forstått; imidlertid er redusert nitrogenoksyd (NO) biotilgjengelighet en kritisk bidragsyter ^27-30 og en felles mekanisme for både svekket EDD og økt arteriell stivhet ^10,31. I CKD, er oksidativt stress øker og bidrar til reduksjon i NO biotilgjengeligheten ^32-34. Oksidativt stress er definert som overdreven biotilgjengelighet av reaktive oksygen arter (ROS) i forhold til antioksidantforsvaret. Fysiologiske stimuli, inc.Luding inflammatorisk signalering, fremme oksiderende enzymsystemer til å produsere ROS, inkludert superoksydanion (O ₂ ● ^-) (f.eks oksidanten enzymet NADPH oksidase.) ^35. Produksjon av superoksid fører til slutt til redusert biotilgjengelighet av nitrogenoksid (NO).

Nedsatt NO biotilgjengelighet i sin tur kan bidra til utvikling av CKD, som endotelial dysfunksjon er en uavhengig prediktor av innfall CKD ^36.. Dette er konsistent med dyr data som indikerer at eNOS hemming induserer hypertensjon (systemisk og glomerulær), glomerulær iskemi, glomerulosclerosis, og tubulointerstitiell skade ^37. Faktisk, redusert NO biotilgjengelighet synes nødvendig for utvikling og progresjon av eksperimentell nyresykdom som etterligner menneskelig sykdom, noe som tyder på en nøkkelrolle for endotelial dysfunksjon i menneskelig CKD ^38,39.

Markører for vaskulær oksidativt stress kan bli vurdert i vascular endotelceller innsamlet fra humane studeres, ved hjelp av en teknikk som opprinnelig utviklet av Colombo et al. ^40. og modifisert Seals et al ^41-43. Ved hjelp av to sterile J-ledninger, blir cellene oppsamlet fra antecubital vene, utvinnes, faste, og senere positivt identifisert som endoteliale celler og analysert for ekspresjon av proteiner som er av interesse ved hjelp av immunfluorescens.

Vi gir her en diskusjon om denne metoden som kan brukes til a) tiltak FMD _BA; b) måle aPWV; c) måling av vaskulær endotelcelle protein ekspresjon av markører for oksidativt stress. Fokuset er på pasienter med CKD, ikke krever kronisk dialyse.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene fra Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB).

En. Forberedelse til testing Session

1. Deltakerne bør følge disse restriksjonene for mest nøyaktige målinger: 12 timers faste fra mat og koffein, 12 timers tilbakeholdenhet fra trening, 12-timers tilbakeholdenhet fra røyking, hvis det er aktuelt,> 4 halveringstid tilbakeholdenhet fra medisiner hvis det er mulig (kan ikke være gjennomførbart i en befolkningen som CKD pasienter), og pre-menopausale kvinner bør testes i dag 1-7 av menstruasjonssyklusen for å minimalisere hormonelle påvirkninger.
2. Forbered 500 ml av dissosiasjon buffer ved tilsetning av 2 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,05 g heparin (180 USP enheter / mg), og 2,5 g kvegserum albumin til 476,8 ml med fosfatbufret saltvann (PBS) ved pH-verdien på 7,4. Det kan lagres ved 4 ° C i flere måneder.
3. Slå på ultralyd, datamaskin, og den ikke-invasiv HemodynamicArbeidsstasjon (NIHem; arteriell stivhet utstyr). Koble kablene sender ut ultralyd til datamaskinen R-bølge trigger boksen.

2. Innsamling og behandling av vaskulær endotelceller

1. En utdannet sykepleier eller lege utfører samling (trinn 2,2-2,5, 2,7) og en forsker samler inn og behandler ledningene (trinn 2.6, 02.08 til 02.19)
2. Prep antecubital stedet med en aktuell antiseptisk, bruke en tourniquet, finn vene, og cannulate med en 18 G kateter. Plasser en heplock adapter på enden av IV.
3. Ta på sterile hansker og sette sterile fenestrated gardiner over området.
4. Plasser to J-ledninger på gardinene. Trekk bue av "J" til å vikle av den "J"-form fra begge ledninger.
5. Slipp ut heplock og mate J-ledning inn i venen ca 8 cm. Skyv frem og tilbake flere ganger før du tar ut ledningen. Unngå brutto blod på wiren.
6. Bruk en avbitertang til klipp ledningene slik at de passer inn i en50 ml konisk rør inneholdende ~ 30 ml av dissosiasjon buffer
7. Gjenta trinn 2,5 for andre wire.
8. Gjenta trinn 2.6 for andre wire. Returner tube til våtlaboratorium.
9. Gripe over ledningene med en pinsett og holde ledningene på innsiden av røret, men over oppløsningen. For 10 min, bruker en motorisert pipetter for å gjentatte ganger samle dissosiasjon buffer fra 50 ml konisk rør og slipper den så den går ned lengden på ledningene til å skylle og vibrere ledningene, så rist av overflødig væske fra ledningene inn røret.
10. Sentrifuger i 7 min ved 400 x g og 4 ° C.
11. Klargjør formaldehydoppløsning i foliedekket rør ved å kombinere 100 ml formaldehyd-løsning + 900 ml PBS.
12. Sakte fjerne røret fra sentrifuge, skru på vakuumpumpe, plassere en pipette spissen på slutten av sugeslangen og la ~ 400 ml i røret, støvsuging av resten uten å forstyrre pelleten.
13. Dekk med folie og pipette 1 ml formaldehydløsning innrøret for å fikse prøven. Ikke insulinet godt blandet. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
14. Forbered 8 lysbilder ved merking med fag-og studiebesøk informasjon og tegne en oval på hvert lysbilde med en pap penn.
15. Tilsett 15 ml PBS, resuspender, og sentrifuger i 5 min ved 400 xg og 4 ° C.
16. Gjenta trinn 2.15, tilsett 12 ml PBS, resuspender, og sentrifuger for 6 minutter ved 400 xg og 4 ° C.
17. Sakte fjerne røret fra sentrifuge, skru på vakuumpumpe, plassere en pipette spissen på slutten av sugeslangen og la ~ 2 ml i røret, støvsuging av resten uten å forstyrre pelleten.
18. Resuspender og pipette jevnt over de åtte lysbilder i de ovale områder.
19. Plasser i inkubator ved 37 ° C i 5 timer og deretter lagre ved -80 ° C til den er klar for analyse (prøvene vil være greit for mange år).

Tre. Vurdering av FMD _BA og aPWV

1. Har forskning lagt endring i disponibel shorts og har him / henne ligge liggende i et rolig, dim, klima kontrollert rom.
2. Plasser riktig antall EKG for den spesifikke ultralyd og arteriell stivhet enhet (denne fremgangsmåten bruker Non-Invasive hemodynamiske arbeidsstasjon [NIHem] for å måle arteriell stivhet, som krever fire elektroder), og blodtrykket cuff på motivet.
3. Etter 20 min, begynner blodtrykket opplesninger. Utføre minst tre, og gjenta til målingene er innenfor 5 mmHg, hvile 2 min mellom hver avlesning.
4. Begynn tonometry ved palpating for brakialarterien puls og plassere tonometer å registrere brachialis bølgeformer ved hjelp av programmet.
5. Gjenta for de radielle, femoral og carotis arteriene.
6. Måle avstanden til hver av disse områdene fra supersternal hakk ved hjelp av et målebånd (brachialis, radial og carotis) og tilpassede hersker / caliper (femur).
7. Beregn carotis-brachialis, carotis-radial, og carotis og lår (aPWV) ved hjelp av programmet.
8. Stedunderarm blodtrykksmansjett bare distal til olecranon prosessen og ta opp minst ti hjerte sykluser av baseline brachialis arterie ultralydbilder og blodstrøm hastighetsmålingene, med en vaskulær programvare satt til å utløse modus. En mekanisk arm kan benyttes til å stabilisere ultralydprobe hvis ønskelig.
9. Blås underarm blodtrykksmansjett til 250 mmHg og begynne tidtaker. Instruere deltaker å forbli veldig stille.
10. Begynn opptakshastigheter med en vaskulær programvare satt til å utløse modus når tidtakeren leser 04:45. Trigger slipper mansjetten på 05:00 og endre ultralyd for å spille B-mode (diameter) bilder når klokken leser 05:10.
11. Fortsett opptaket til klokken leser 07:00.
12. Rekord minst 10 hjerte sykluser av baseline brachialis arterie ultralydbilder med en vaskulær programvare satt til å utløse modus.
13. Ta motivets blodtrykk. Hvis systolisk blodtrykk> 100 mmHg, plassere 0,4 mg sublingual nitroglyserin under emne &# 39; s tunge og begynne tidtaker, med mindre pasienten har en annen kontraindikasjon.
14. Begynn opptak B-mode (diameter bilder) når klokken leser 3:00 med vaskulær programvare satt til å utløse modus.
15. Stoppe opptaket når klokken leser 08:00.
16. Overvåk blodtrykk før den returnerer til baseline

4. Forbereder Menneskelig navleveneendotel Cell (HUVEC) Kontroll Slides

1. Grow HUVECs til passasje 5-6 og ~ 80% confluency.
2. Trypsinize med 3 ml trypsin eller hva er nødvendig for parabolen / kolbe.
3. Nøytraliser trypsin ved hjelp av et like stort volum av trypsin nøytraliserende løsning.
4. Sentrifuger ved 200 x g i ~ 5 min, og fjerne trypsin-og nøytraliserende oppløsning ved hjelp av vakuum.
5. Suspender i ~ 10 ml PBS å vaske.
6. Sentrifuger ved 200 xg ~ 5 min. Fjern PBS.
7. Fjern PBS og fikse i 1800 mL PBS + 200 mL formaldehyd.
8. Resuspender i PBS (~ 10 ml).
9. Sentrifuger ved 200 xg ~5 min. Fjern PBS, resuspender i en passende volum å legge ~ 200 mL per lysbilde.
10. Lagre lysbilder ved -80 ° C til den er klar for analyse (prøvene vil være greit for mange år).

5. Farging av vaskulær endotelceller

1. Ta glir ut av -80 ° C fryser og vent 5 min ved romtemperatur (denne fremgangsmåten er en gruppe med 10 snitt, inkludert en HUVEC styreglide).
2. Tørk bort overflødig vann med en delikat oppgave tørke (ikke røre sentrum av lysbilde).
3. Re-hydrat lysbildene ved å legge endret PBS til hvert lysbilde og la dem i 10 min.
4. Mens lysbildene står, forberede 5% esel serum og andre løsninger.
   1. Forbered 5% esel serum ved å legge til 300 mL av esel serum til 5700 mL av endret PBS (til pH 7,4) for inntil 10 lysbilder (øke dette beløpet for mer).
   2. Fortynn det primære antistoffet av interesse i 1000 pl av 5% serum. For eksempel, nitrotyrosine og NADPHoksidase (1:300 og 1:1,500) kan brukes som markører for oksidativt stress.
   3. Forbered sekundær AF568 ved å fortynne 5 mL av AF568 til 1500 μll av 5% serum.
   4. Forbered VE cadherin ved å fortynne 2 mL av VE Cadherin til 1000 mL av 5% serum.
   5. Forbered AF488 ved å fortynne 5 mL av VE Cadherin til 1000 mL av 5% serum.
   6. Hold AF568, VE cadherin og AF488 henhold folie gjennom hele prosessen, og deretter plassere på rocker i 4 ° C kjøleskap mens forbereder lysbilder.
5. Etter 10 min av utvanning, tørre lysbilder med en delikat oppgave tørk.
6. Legg 5% esel serum i 60 min og legg et stykke plast parafin film over sirklet området for å sikre full dekning av kjemikaliet.
7. Kast plast parafin film og tørre lysbilder med en delikat oppgave tørk. Ikke vask. Legg primære antistoff i 60 min, og plassere et stykke plast parafin film over den sirkel-området for å sikrefullstendig dekning av kjemikaliet.
8. Kast plast parafin film, skyll med endret PBS fra sprute flaske og suge i lysbilde kolonner for 5 min. Mens lysbildene er soaking, flytte dem inn i et mørkt rom. Arbeide i mørket for alle gjenværende trinnene.
9. Tørre lysbilder med Kimwipes, legge AF568 (sekundært antistoff) i 45 min og legg et stykke plast parafin film over sirklet området for å sikre full dekning av kjemikaliet. Dekk mot lys.
10. Kast den plastparafinfilm i biologisk avfallsbeholder. Skyll med endret PBS fra sprut flaske, og deretter suge i kolonner for 5 min.
11. Tørre lysbilder med Kimwipes, deretter legge VE Cadherin i 60 min og legg et stykke plast parafin film over sirklet området for å sikre full dekning av kjemikaliet. Dekk mot lys.
12. Kast den plastparafinfilm i biologisk avfallsbeholder. Skyll med endret PBS fra sprut flaske, og deretter suge i kolonner for 5 min.
13. Tørre lysbilder meden delikat oppgave tørke, legge AF488 i 30 min, og legg et stykke plast parafin film over sirklet området for å sikre full dekning av kjemikaliet. Dekk mot lys.
14. Kast den plastparafinfilm i biologisk avfallsbeholder. Skyll med endret PBS fra sprut flaske, og deretter suge i kolonner for 5 min.
15. Tørre lysbilder med en delikat oppgave tørk og la lysbilder tørke i 20 min. Dekk mot lys.
16. Tilsett en dråpe bare av fluoroshield montering medium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole hydroklorid (DAPI) til hvert lysbilde og dekke hver med et dekkglass.
17. Plasser lysbilder i 4 ° C kjøleskap dekket med folie. Imaging må være fullført innen 48 timer.

6. Imaging and Analysis of Vascular endotelceller

1. Forbered mikroskop for imaging farget endotelceller i henhold til spesifikasjonene for den spesifikke mikroskop. En enkelt blindet tekniker skal analysere en bestemt protein for en flaggermusch av celler.
2. Skanne lysbilder systematisk. Identifiser endotelceller etter positiv farging for VE Cadherin og bekrefte atom integritet ved positiv farging for DAPI.
3. Bilde 30 celler per lysbilde for senere analyse. Gjenta for hver side i en farget batch, inkludert HUVEC.
4. Analyser intensiteten av fargingen for det primære antistoff av interesse ved hjelp av en kvalitativ programvare.
5. For å minimere mulig forvirrende innvirkning av forskjeller i intensitet farging mellom forskjellige fargings sesjoner, rapport verdier i prosent av proteinekspresjon i de innsamlede endotelceller til det samme protein ekspresjon i HUVEC.

Representative Results

FMD _BA er kvantifisert som toppen endring i diameter brakialarterien følgende reaktiv hyperemia. Således er diameteren i ro i forhold til diameteren etter utløpet av en 5 min blodtrykksmansjett okklusjon perioden (fig. 1). Panel A viser en representativ ultralydbildet av brakialarterien og Panel B viser en grafisk fremstilling av R-bølgen gated endring i diameter fra mansjetten utslipp til 2 min følgende, som oppnådd ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Når endringen er ofte ganske minimal (I figur 1 er endringen 4,8%), kan små forskjeller i måle har store konsekvenser for resultater. Bruk av kommersielt tilgjengelig automatisert kantdeteksjon programvare er sterkt anbefalt for å redusere fordommer og potensielle feil i målingen ^44,45. Som stimulans for utvidelse i løpet av reaktiv hyperemia kan variere mellom grupper eller tilstander sammenlignes, bør skjærhastighet beregnes ved hjelp av Doppler blodstrømhastigheter, og FMD _BA bør justeres for forskjeller når gjeldende ^46,47.

aPWV beregnes med minimal operatør innspill av de fleste kommersielt tilgjengelige systemer, inkludert NIHem brukt i vår forskning. Den R-bølgen av EKG blir sammenlignet med "fot" av bølgeformen på et gitt område, og tidsforskjellen beregnes (figur 2) for halspulsåren (panel A) og lårarterien (panel B). De avstandsmålinger blir brukt i forbindelse med tidsforskjellene til å beregne en hastighets. aPWV refererer til hastighet mellom halspulsåren til lårarterie (ie. langs aorta).

Immunofluorescent analyse av vaskulære endotelceller kan gi celle bevis på nivået av oksidativt stress. For å ta hensyn til forskjeller i fargeintensiteten mellom fargings sesjoner, nivået av fluorescens i et gitt protein for hvert enkelt emne (representative ima ger som er vist i figur 3. Panel A) blir sammenlignet med fluorescensen av HUVEC styreskyveren (representative bilder er vist i figur 3. Panel B). Således kan forskjeller i protein ekspresjon sammenlignes enten mellom grupper eller over forhold (for eksempel i løpet av en intervensjon studien).

Figur 1. Representant baseline brakialarterien diameter innhentet under vurdering av brachialis arterie flow-mediert dilatasjon (FMD _BA). A) I en pasient med kronisk nyresykdom (CKD). B) R-bølge gated endring i diameter fra mansjetten utslipp til 2 min følgende vises grafisk, som oppnås ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare.target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Representative resultater utskrift fra vurdering av aPWV hos en pasient med CKD. A) Tidsforsinkelse fra R-bølgen i EKG-til foten av halspulsåren, B) tidsforsinkelse fra R-bølgen i EKG-til foten av lårarterie (tfoot), overlappende med carotis bølgeform. Begge paneler fremgår også av innmatede avstander fra suprasternal hakk i de respektive områder (som representeres av bokstaven D, i cm). Den beregnede aPWV verdi er vist i panel B (representert ved bokstavene PWV, i cm / sek). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ P>

Figur 3. Representative bilder av protein uttrykk. A) DAPI (kjerneintegritet, blå), VE Cadherin (positiv endotelcelle identifikasjon, grønn) oksydanten enzym NADPH oksidase (protein av interesse; red) fra celler oppsamlet fra en pasient med kronisk nyreinsuffisiens, B) og for en human umbilical vene endotel celle (HUVEC) kontroll lysbilde.

Discussion

Innhenting nøyaktige resultater for FMD _BA og aPWV krever anskaffe høykvalitets ultralydbilder og trykkbølgeformer, hhv. Sentralt i dette er hensiktsmessig og fortsatt trening og bruk av hver teknikk av operatøren ^44.. I tillegg er det viktig å kontrollere så mange eksterne variabler som kan påvirke resultatet som mulig ved standardisering av test sesjon (som tidligere 12 t fast, klimakontrollert rom, etc.) ^44,45. Som nevnt ovenfor, er bruken av kommersielt R-bølge gated oppkjøpet programvare og kant-deteksjon programvare sterkt anbefalt å redusere skjevhet og potensielle feil i målingen ^44,45. Når FMD _BA er svekket, kan dette være enten på grunn av nedsatt NO utgivelse fra endotelet eller på grunn av nedsatt reaksjonsevne av de vaskulære glatte muskulaturen til NO utgitt. Sublingual nitroglyserin administreres å kontrollere for respons av den glattemuskel celle laget til en eksogen nitrogenoksid donor, for å konkludere med at fall FMD _BA er spesifikke for evnen til blodåreendotelets å produsere nitrogenoksid ^44,45.

Ettersom målingen er en hastighet, nøyaktige målinger av både avstand og tid er kritiske. Protokollen har vi beskrevet er basert på metoden som er anvendt i Framingham Heart Study ^24.. Bruk av hevet calipers snarere enn et målebånd forbedrer nøyaktigheten på måling av avstand fra suprasternal hakk til lårarterie ved å ta en direkte bane heller enn potensiell måle løpet abdominal fedme. En klar "fot" av en ren bølgeform er absolutt nødvendig for beregning av tidsforskjellen i forhold til R-bølgen i EKG til impulsen på målestedet (se figur 2).

Selv om alternative teknikker er tilgjengelige for å vurdere både endotelial funksjon og arriale stivhet, FMD _BA og aPWV er begge vanligvis brukes i klinisk forskning fordi de er ikke-invasiv og godt etablert som mellomledd utfall. I tillegg er de også validert på tvers av ulike populasjoner og uavhengig er prediktive for kardiovaskulære bivirkninger og dødelighet ^19-26. Således kan de brukes som surrogat endepunkter i kliniske studier som vurderer effekten for en intervensjon for å redusere kardiovaskulær risiko hos en gitt populasjon, for eksempel hos pasienter med CKD. Modifisering av disse teknikkene er ikke nødvendig å spesifikt studere pasienter med CKD, i forhold til andre populasjoner i fare for hjerte-og karsykdom.

Men det er viktige begrensninger i både FMD _BA og aPWV som fortjener diskusjon. FMD _BA vurderer vaskulær endotelial funksjon av en stor kanal arterie (brachialis arterie), og dermed ikke gir en indeks for mikrovaskulær endotelfunksjon. En egen teknikk med venøs okklusjon plethysmography er bedre egnet til å vurdere den sistnevnte. Men denne metoden krever kateterisering av brachialis arterien, som er mer invasive enn FMD _BA og kan være kontraindisert hos pasienter med CKD. I tillegg er måling av FMD _BA krever omstendelige og spesiell opplæring for å kunne utføres også. aPWV gir en indeks for stor elastisk arterie stivhet, som kan være forskjellige fra lokale arteriell stivhet (slik som halspulsåren). En alternativ teknikk for å vurdere arteriell stivhet er å måle den lokale arteriell compliance (den inverse av stivhet) av halspulsåren, selv om dette ikke er så mye brukt eller validert med kliniske endepunkter som aPWV ^13. I tillegg, kan bidraget fra NO som en determinant for aorta stivhet varierer etter vaskulære bed ^48.. Siste, er det potensielle confounds til tolkningen av både FMD _BA og aPWV som trenger å bli målt og statistisk justert for som hensiktsmessig, inkludert baseline diameter og skjærhastighet for FMD _BA ^45, og hjerterytmen og blodtrykket for aPWV ^49.

Et viktig hensyn ved innsamling av vaskulære endotelceller blir minimere blod på J-ledninger og deretter på skinnene, slik at de endotelcellene kan bli identifisert med minimal røde blodlegemer som overlapper i bildene. Dette kan oppnås med trening for riktig teknikk, så vel som tilfredsstillende vasking ved å utvinne cellene. Når du analyserer lysbildene, er det avgjørende at fluorescens objektivt kan kvantifiseres og bildene er klare, uten mye bakgrunn eller overlapper med andre celler. Optimalisering av fortynninger for beising og teknikk for mikroskopi analyse før analysen av studie prøvene er viktige skritt. Av notatet cellen utbyttet av denne teknikken er ~ 600 vaskulære endoteliale celler pr samling, en utilstrekkelig mengde av den totale mRNA er tilgjengelig for å måle genekspresjon, og dermed begrense vår proben til immunofluorescent farging av proteiner av interesse.

I tillegg til de teknikker som er presentert for å vurdere vaskulær oksidativt stress, sirkulerende eller urin markører kan anvendes for å vurdere oksidativt stress ^12,50. De kan imidlertid være mindre reflekterende av nivået av oksidativt stress spesifikke for nivået av det vaskulære endotel. Ved hjelp av disse markørene i kombinasjon med de presenterte teknikkene kan gi den beste indikasjon på det generelle nivå av oksidativt stress.

Vi har gitt en oversikt over fremgangsmåter som kan brukes til å måle FMD _BA, aPWV, og vaskulær endotelcelle proteinekspresjon. Disse teknikkene er egnet ikke bare for pasienter med CKD, men også i andre populasjoner med økt risiko for kardiovaskulær sykdom. Samlet gir de innblikk i vaskulær endotelial dysfunksjon, stor elastisk arterie stivhet, og bidra fysiologiske mekanismer, inkludert oksidativt stress.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J-wire	St. Jude	404584	2 per collection
Disposable shorts (MediShorts)	Quick Medical	4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem)	Cardiovascualr Engineering	N/A	Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound	G.E.	Model: Vivid7 Dimension	We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)	Medical Imaging Applications	N/A
R-wave trigger box	Medical Imaging Applications	N/A	custom made
Rapid Cuff Inflation System	Hokanson	Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff	Hokanson	N/A	custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder
HUVECs	Invitrogren	C-015-5C
Donkey serum	Jackson	017-000-121
Pap pen	Research Products International	195505
VE Cadherin	Abcam	ab33168
AF568	Life Technologies	A11011	depends on specifications of microscpe
AF488	Life Technologies	A11034	depends on specifications of microscpe
Nitrotyrosine antibody	Abcam	ab7048
NADPH oxidase antibody	Upstate	07-001
DAPI	Vector	H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)	Fisher Scientific	06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)	Fisher Scientific	13-374-10
Confocal microscope	Olympus	Model: FV1000 FCS/RICS	many options exist