一种改进在体外入侵检测，以确定激素，在调节肿瘤细胞侵袭的细胞因子和/或生长因子的潜在作用

Summary

这篇视频文章描述了一种改进的体外方法，用于检查激素、细胞因子和/或生长因子在驱动癌细胞侵袭中的作用。

Abstract

血清作为趋化对其中的癌细胞迁移和侵袭，促进他们的血管内进入微血管。然而，实际的分子朝向该细胞迁移仍然无法实现。本变形侵袭实验已经开发，以确定哪一个驱动器细胞迁移和侵袭的目标。这种技术比较下三个条件的侵袭索引，以确定是否一个特定的激素，生长因子，细胞因子或在介导癌细胞的侵袭性潜力的作用。这些条件包括：i）正常牛胎儿血清（FBS），ⅱ）活性炭处理的FBS（CS-FBS）的功能，从而激素，生长因子，以及细胞因子和iii）的CS-FBS +分子（表示为“X”）。相比FBS细胞侵袭与CS-FBS的显著的变化，表明激素，细胞因子和生长因子介导的变化的参与。各个分子然后可以重新添加到CS-FBS以测定他们的重新能力诗句或抢救入侵表型。此外，两个或更多的因素可以结合，以评估该添加剂或多种分子在驾驶或抑制侵袭协同效应。总体而言，该方法能够使研究者确定是否激素，细胞因子，和/或生长因子通过作为化学引诱物或侵入的抑制剂为特定类型的癌细胞的或特定的突变体在细胞侵袭的作用。通过识别特定的趋化因子和抑制剂，这个修改后的入侵检测可能有助于阐明信号通路，直接癌细胞侵袭。

Introduction

一种新颖的侵袭实验研制了具有确定具体激素，细胞因子和/或生长因子如癌细胞侵袭化学引诱物的参与的目标。肿瘤细胞侵入通过细胞外基质（ECM）的能力，是在转移表型^1-3的一个标志。入侵室已被广泛用作体外的工具来研究癌细胞的侵袭和转移，并可以提供知识， 体内肿瘤的侵袭和转移的机制。 腔室包括嵌套细胞培养板的孔中的圆柱形的细胞培养插入物。插入件的底部是限定孔径的半透聚碳酸酯或聚苯乙烯膜。

在标准侵袭实验，将细胞接种到在插入膜用无血清培养基，并置于细胞培养孔被填充有血清或血清样化学引诱物送等了一个趋化的力量。移动至该力驱动细胞通过的半透膜（迁移）或可替代地，通过细胞外基质（侵入），然后可以使用常规的染料检测和定量细胞数染色的涂层。细胞数，然后根据迁移和侵袭的非侵入性的细胞系的范围内归一化。此方法允许研究者评估在各种条件，包括遗传操作不同类型的细胞的侵袭性潜力。

激素，细胞因子和生长因子是血清的关键组成部分，并越来越多地被示出为与驱动侵袭性表型⁴相关联。然而，在自然界，角色，和特异性这些趋化血清分子仍然介导入侵仍然无法实现。我们面临的挑战仍然是确定哪些具体因素血清或血清样趋化因子负责驾驶癌细胞侵袭以及什么分子可以抑制入侵过程。在这份报告中，我们描述了一种方法来评估潜在激素，细胞因子和/或血清中存在的生长因子的参与，如分子找到癌细胞的趋化....

Protocol

1.准备不同的媒体和其他组件

1. 事先进行实验，制备介质选自由DMEM或其他指定的介质中，并添加任一正常胎牛血清，木炭剥离的FBS，或木炭剥离的FBS加组件进行测试。需要注意的是多个组件可以在每个实验进行测试。
2. 称出并稀释的激素，生长因子，细胞因子或适当地在生理浓度溶解在木炭脱色的血清。

2.准备胶原基质上的冰

1. 制备2毫升胶原I基质中2.2毫克/毫升通过在冰上加入以下无菌过滤组件：加入200μl10倍的PBS（pH为7.4），5.4微升的1N NaOH，600微升双蒸H ₂ O为和1.2毫升胶原I （在3.63毫克/毫升）。
2. 保持胶原蛋白I溶液在冰上，直到准备板。

3.准备迁移/侵袭板用于分析

1. 对于要测试的每个细胞系，使用一种24孔室板，其中12孔含有插入。使用额外的12个孔不含有插入用于将趋化介质和转印刀片为实验的设置。
   注：在平板上用聚乙烯对苯二甲酸盐（PET）膜和8微米孔径胶原基质是最适合的细胞系用在这里。然而，在预涂板一个基质胶基质也可以取代的孔径根据细胞系被调查下降。
2. 清楚地标注板，采用每条件3口井被分析（FBS迁移，CS-FBS迁移，FBS侵袭，而CS-FBS侵袭以及FBS迁移的控制，非侵入性的细胞系）。通过移动通孔运动中的PET膜，并测定....

Results

入侵指数是根据归一化，以一种非侵入性的细胞系计算每个条件。对于我们的实验中，我们使用1205LU黑素瘤细胞系，建立了变体的稳定细胞株作为我们的侵入线以及癌前无创变型中，WM793从中1205LU细胞衍生¹⁰用作一个逻辑控制。我们还利用I型胶原作为基质侵入，因为这是真皮的主要成分。这是根据先前的研究，从而最优侵袭基质变化的基础上的细胞系和一致性的与体内的程度的结果^11。这种侵袭实验是根据可能的结果研究者可能获得所概述示意。最初，为2％FBS的侵袭指数应该比为CS-FBS的侵袭指数显著更高或更低，以便对本测定法（ 图1和2）。如果显著增量缓和或减少入侵指数与活性炭处理的FBS明显看出，该测定是不是为研究者（ 图2和3）是有用的。如果此增加与活性炭处理的FBS消除，研究者已经具有增强的入侵朝向激素，生长因子，或细胞因子（ 图2和3）的知识。然后，研究者必须利用有关特定肿瘤类型和变异，以确定哪些候选人（S）目前可行的机制趋化因子的信息。研究者可以开始通过尝试的一个或几个部件分别在生理.......

Discussion

肿瘤转移是一个多步骤的过程。细胞必须通过基底膜断裂，intravasate成要么淋巴系统或血液微血管，它们被运到远处位点。肿瘤细胞然后外渗和移成macrometastasis ^12。通过上皮间质转化（EMT），肿瘤侵袭和转移的进展已增强了类固醇激素^13,14，生长因子^15-18和细胞因子^19-21。这些分子是如此关键，解决肿瘤进展的信号通路，即化验的发展，以解决他们在肿瘤侵入的潜在作用是对破译复杂的信号通路中的重要一步。

用活性炭处理血清的该测定具有比现有的方法的一个优点，因为它的目的是确定要向其肿瘤细胞迁移的驱动力。先前试剂盒使用正常的原发性乳腺癌成纤维细胞浸润室已经出版。在这项研究中，作者使用活性炭处理的媒体和在基质胶室其中没有造成侵如预期，因为细胞不会致瘤性加回雌激素。然而，在存在或不存在雌激素的巨噬细胞条件培养基的存在下显著和类似的程度²²增加的侵袭。而该测定是相似，它用于入侵检测与在不存在或雌激素的存在木炭脱色的血清，这不是一个肿瘤测定，并针对巨噬细胞和成纤维细胞.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioCoat 对照插件，带 8.0 & micro;m PET 膜	康宁	354578	12 个，分别装在两个 24 孔板中。PET = 聚对苯二甲酸乙
胶原蛋白 I，大鼠尾	康宁	354236	来源 = 大鼠尾巴肌腱，纯度 = 90%
固定剂;Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	基于甲醇的固定剂、苏木精/伊红
胎牛血清	Life Technologies	16000	指定为 FBS
木炭剥离胎牛血清	Life Technologies	12676	指定为 CS-FBS
胎牛血清	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	FBS
木炭剥离胎牛血清	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	指定为 CS-FBS