Модифицированный<em> В пробирке</em> Вторжение Пробирной для определения потенциальной роли гормонов, цитокинов и / или факторы роста в посредничестве клеточного рака Вторжение
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
В сыворотке крови служит хемоаттрактант, к которой раковые клетки мигрируют и вторгнуться, облегчая их intravasation в микрососудов. Тем не менее, фактические молекулы, к которой клетки мигрируют остаются неизвестными. Это измененный вторжением анализ был разработан для определения целей, которые управляют миграцию клеток и вторжения. Этот метод сравнивает индекс вторжения при трех условиях, чтобы определить, фактор роста, цитокин или играет ли конкретный гормон роль в опосредовании инвазивный потенциал раковых клеток. Эти условия включают в себя I) нормальным фетальной бычьей сыворотки (FBS), II) уголь-лишен ФБС (CS-FBS), который удаляет гормоны, факторы роста и цитокины и III) молекулу, CS-FBS + (обозначается "X"). Существенное изменение в клеточной инвазии с CS-FBS, по сравнению с FBS, указывает на вовлечение гормонов, цитокинов или факторов роста в опосредовании изменение. Отдельные молекулы затем могут быть добавлены обратно в CS-FBS для анализа их способность повторностих или спасти фенотип вторжения. Кроме того, два или более факторов, могут быть объединены, чтобы оценить дополнительный или синергический эффект нескольких молекул в движении или ингибирования инвазии. В целом, этот метод дает возможность исследователю, чтобы определить, является ли играть роль в инвазии клеток гормоны, цитокины и / или факторы роста, служа хемоаттрактанты или ингибиторов инвазии для конкретного типа раковой клетки или конкретного мутанта. Путем выявления конкретных хемоаттрактанты и ингибиторы, этот измененный вторжением анализ может помочь выяснить пути, которые прямого вторжения раковых клеток сигнализации.
Introduction
Роман вторжение анализ был разработан с целью выявления участия конкретных гормонов, цитокинов и / или факторами роста, как хемоаттрактантов в вторжения раковых клеток. Способность опухолевых клеток вторгнуться через внеклеточного матрикса (ЕСМ) является отличительной чертой метастатического фенотипа 1-3. Вторжение камеры были широко использованы в качестве инструментов в пробирке для изучения вторжение раковых клеток и миграции, и может обеспечить знаний в отношении механизмов в естественных опухолевой инвазии и метастазирования. Камеры состоят из цилиндрических вкладышей для культивирования клеток, вложенных в лунки для культивирования клеток пластин. Днища вставок являются полупроницаемые поликарбоната или полистирола мембраны определенных размеров пор.
В стандартном анализе инвазии, клетки высевают на пластины с мембраной свободных средств массовой информации сыворотки и помещают в лунки для культивирования клеток, которые заполнены сыворотки или в сыворотке, как хемоаттрактанты чтобы си др до chemoattractive силой. Это диски сила клетки для перемещения через полупроницаемую мембрану (миграции) или, альтернативно, через покрытие внеклеточного матрикса (вторжения), которые затем могут быть окрашены с использованием обычных красителей, чтобы обнаружить и определить число клеток. Число клеток затем нормализованы в зависимости от степени миграции и инвазии в неинвазивной клеточной линии. Этот метод позволяет исследователю оценить инвазивный потенциал различных типов клеток при различных условиях, в том числе генетических манипуляций.
Гормоны, цитокины и факторы роста являются важными компонентами сыворотки и чаще показано, что связано с вождением инвазивный фенотип 4. Тем не менее, природа, роль и специфика этих chemoattractive молекул в сыворотке крови посредником вторжение еще остаются неизвестными. Задача по-прежнему, чтобы определить, какие конкретные факторы в сыворотке или сыворотки, как хемоаттрактантов несут ответственность за вождениевторжение раковых клеток, а также то, что молекулы могут ингибировать процесс инвазии. В этом докладе мы описываем методологию для оценки потенциального участия гормонов, цитокинов и / или факторов роста, присутствующих в сыворотке крови, так как молекулы вождения хемоаттракции и проникновение раковых клеток.
В этом предлагаемого модифицированного протокола, древесный уголь зачистки используется для удаления гормоны, цитокины и факторы роста от 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы генерировать 2% FBS уголь зачищенный (CS-FBS). И 2% FBS и 2% FBS, CS-используют в качестве агентов для настройки chemoattractive силу для управления инвазию раковых клеток. С использованием 2% CS-FBS в chemoattractive агента по сравнению с обычной 2% FBS дает несколько преимуществ, включая первую и наиболее заметно, способность к обучению на инвазию раковых фенотип в восстановленном / относительном отсутствии гормонов, цитокинов и факторов роста. Это позволяет экспертам оценить, является ли коллективной удаления гормонов, факторов роста, и суtokines вызывает увеличение или уменьшение инвазивной индекса. Анализ затем предназначен для определения того, добавление отдельного компонента, обозначенного как "X" может ингибировать, уменьшение, увеличение или восстановление инвазивной индекс к исходному значению (рисунки 2 и 3). Хотя эта методика является специфическим для достижения физиологические уровни компонента, который удаляется из сыворотки во уголь зачистки, следует также отметить, что древесный уголь зачистки также может влиять путей сигнальной трансдукции. Например, сообщалось, что уголь зачистки может уменьшить активность щелочной фосфатазы из osteoprogenitor клеток и индуцируют липогенез за счет снижения МАРК активаторов 5. Древесный уголь лишенные средств массовой информации, являются коммерчески доступными и основаны на протоколе указано, что сочетает в себе уголь с декстрана и инкубируют с эмбриональной бычьей сыворотки O / N 6.
Этот анализ был разработан в RESPONSE в результате сообщенных Zucker и др. 7 Авторы показали, что мутант фенотип влияет щелевых связи продемонстрировал увеличение индекса инвазии при переходе к среде с нормальной 2% FBS. Это увеличение было устранено с заменой древесного угля раздели сыворотке крови. Из этого результата, авторы пришли к выводу, что этот мутант зависит миграции к липофильной молекулой (более конкретно, гормон, фактор роста, цитокин или) 7. Хорошо известно, что гормоны, факторы роста и цитокины опосредуют путей, участвующих в продвижении и инвазия опухоли 4 сигнализации. Таким образом, это важно для ученых-исследователей, чтобы определить, какой фактор (ы) за рулем опухоли вторжение своих конкретных раковых клеток или мутантов в стадии изучения. Анализ предназначен для решения роли отдельных компонентов по их физиологической концентрации, как определено в соответствии с разницей между концентрацией компонента &# 8220; X "в нормальном FBS и CS-FBS. Благодаря развитию этого анализа, исследователи могут получить более глубокое представление о конкретной инвазивной пути, регулирующего их системы.
Гормоны, факторы роста и цитокины, часто были классифицированы как опухолевых промоторов 8. Некоторые из этих факторов, таких как EGF, используются в качестве непосредственных источников для хемоаттрактанты в инвазии камер 9. Таким образом, вполне вероятно, что они представляют собой основные компоненты сыворотки этого вторжения прямой опухоли. Этот протокол предлагает простой, но существенный, модификацию обычного экстракорпорального вторжения анализе, который позволяет исследователю оценить участие гормонов, факторов роста и цитокинов в опосредовании инвазивный потенциал раковых клеток. Тем не менее, анализ предназначен для обеспечения следователю с ответа на вопрос, будет ли процедура эффективно для их изучения на ранней стадии в анализе, так как не использовать драгоценное время и гЕСУРСЫ если это будет сочтено ненужным. Этот метод использует CS-FBS и полагается на усмотрение следователей, какие молекулы преследовать в качестве ведущих кандидатов, которые потенциально опосредуют вторжение раковых клеток. Результаты этих анализов должны оказаться полезным в определении, какие компоненты сыворотки служить хемоаттрактанты или ингибиторы для конкретной клеточной линии или мутанта изучается. Кроме того, этот подход может помочь следователь определить ключевые сигнальные пути либо способствующие или мешающие вторжение раковых клеток; Таким образом, направление будущих созданию лекарственных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухоль метастазы многоступенчатый процесс. Клетки должны прорваться через базальную мембрану, intravasate ни в одну лимфатической системы и кровеносных микрососудов, в которых они перевозятся в отдаленные участки. Опухолевые клетки затем extravasate и колонизировать в macrometastasis 12. Прогре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
References
- Weinberg, R. A. . The Biology of Cancer. , (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
