في ترنسفكأيشن المجراة من الحمض النووي عارية عن طريق التسليم الجين الهيدروديناميكية يدخل الجينات في الأنسجة حيوان مع الحد الأدنى من الاستجابة الالتهابية. تتولد كميات كافية من الجين المنتج بحيث ظيفة الجين والتنظيم فضلا عن بنية البروتين وظيفة يمكن تحليلها.
التعبير كفاءة من الجينات المحورة في الجسم الحي هو من الأهمية بمكان في دراسة وظائف الجينات وتطوير علاجات للأمراض. على مدى السنوات الماضية، والتسليم الجين الهيدروديناميكية (HGD) برز بوصفه وسيلة بسيطة وسريعة وآمنة وفعالة لإيصال الجينات المحورة في القوارض. تعتمد هذه التقنية على القوة الناتجة عن حقن السريع لكمية كبيرة من محلول الفسيولوجية لزيادة نفاذية أغشية الخلايا من الأجهزة perfused وبالتالي تقديم الحمض النووي في الخلايا. واحدة من المزايا الرئيسية لHGD هو القدرة على إدخال الجينات المحورة في خلايا الثدييات باستخدام الحمض النووي البلازميد عاريا (PDNA). إدخال جين الخارجية باستخدام البلازميد هو شاقة الحد الأدنى، كفاءة عالية و، خلافا لناقلات الفيروسية وآمنة بشكل ملحوظ. واستخدمت في البداية لتقديم HGD الجينات في الفئران، ويتم استخدامه الآن لتقديم مجموعة واسعة من المواد، بما في ذلك [أليغنوكليوتيد، الكروموسومات الاصطناعية، RNA، البروتينات والجزيئات الصغيرة في الفئران والجرذانو، إلى درجة محدودة، والحيوانات الأخرى. يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران، ويركز على ثلاثة جوانب رئيسية للطريقة التي تعتبر بالغة الأهمية لتنفيذ الإجراء بنجاح: الإدراج الصحيح للإبرة في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. يتم إعطاء أمثلة لإظهار تطبيق هذا الأسلوب إلى التعبير عابرة من اثنين من الجينات التي تكود يفرز والبروتينات الرئيسيات محددة، ئي LI (APOL-I) والبروتين المتصلة هابتوغلوبين (HPR).
ليو وآخرون. وتشانغ وآخرون، أصبح إيصال الجينات الهيدروديناميكية (HGD) منذ أول وصف من قبل أداة لا تقدر بثمن لدراسة وظائف الجينات في نظم نموذج القوارض 1، 2. والأسلوب الذي ينطوي على حقن السريع (5-7 ثانية) من حجم كبير (8-12٪ من وزن الجسم) من الحل في الوريد ذيل الفئران لتسهيل امتصاص الحمض النووي البلازميد بواسطة خلايا الأعضاء المستهدفة 1، 2. هذه الظروف تؤدي إلى التعبير الجيني قوية في الكبد وأقل التعبير الجيني في الكلى والطحال والرئة والقلب.
حقن 10 ميكروغرام pCMV-LacZ البلازميد يمكن بالنقل بقدر 40٪ من خلايا الكبد، مما يجعل HGD الأكثر كفاءة، غير الفيروسية، في الجسم الحي طريقة إيصال الجينات إلى تاريخ 1. على عكس شركات الطيران الفيروسية، PDNA هي سهلة التحضير، لا تثير استجابة مناعية في المضيف القوارض 3 و لا تشكل مخاطر على الصحة من خلال إعادة مزج مع نهايةogenous الفيروسات. بالإضافة إلى ذلك، منذ جزيئات الحمض النووي التي ألقاها HGD لا تحتاج التعبئة والتغليف، وهذا الأسلوب هو مناسبة لإيصال الكروموسومات البكتيرية المصطنعة (BAC) كبيرة مثل 150 كيلو بايت 4. أنواع أخرى من الجزيئات التي تم تسليمها من خلال طريقة الهيدروديناميكية تشمل الحمض النووي الريبي 5-10، morpholinos 11، والبروتينات 12 و 13 و الجزيئات الصغيرة الأخرى 12 و 14. وقد نوقشت مزايا ومساوئ HGD أكثر من غيرها من طرق التسليم في الاستعراضات ممتازة في الأدب 15-20 وقدمت عددا من الكتاب وصفا تفصيليا للإجراءات 21-23.
إدخال الجينات المحورة في الفئران عن طريق HGD هي آمنة وفعالة 1-3، 24، واستخدمت الأسلوب في الفئران مقارنة مع النجاح 25. مع بعض التعديلات، وقد أجريت إثبات صحة مفهوم التجارب في الدجاج 26، راببت 27 و 28 الخنازير، على الرغم من أن في الجسم الحي تطبيق هذه التقنية في الحيوانات الكبيرة لا تزال تشكل تحديا. عند استخدام هذا الأسلوب، الحد آخر شائع هو أن العديد من ناقلات التعبير الثدييات المتاحة تفتقر إلى المكونات لتحقيق الثابتة، ومستوى عال من التعبير الجيني. باستخدام pCMV لوك البلازميد، التعبير الجيني في الأجهزة المستهدفة هو واضح في وقت مبكر بعد عشر دقائق HGD، ومع ذلك، يسقط الأولية، وارتفاع مستوى التعبير بشكل حاد في الأسبوع الأول بعد الحقن 1. طويلة الأجل التعبير التحوير من الممكن اعتمادا على المروج وإنترون المستخدمة في تصميم البلازميد 3، 24 الحقن ومع ذلك، والحفاظ على التعبير الجيني على مستوى عال في كثير من الأحيان يتطلب المتكررة. لهذا السبب، HGD قد تكون أقل مناسبة لدراسة الأمراض المزمنة التي هي نتيجة التعرض الطويل الأمد للبروتينات ضارة أو منتجات البروتين. مع هذه القيود، HGD هو أداة قوية بشكل استثنائي لدراسة بودور tential من الجينات وتأثير ذلك المسوخ في الجسم الحي، فضلا عن الآثار العلاجية وتنظيم البروتينات وإنشاء نماذج حيوانية من المرض (للمراجعة، انظر 15). على سبيل المثال، HGD يمكن أن تستخدم لتعيين وظيفة إلى مجالات والأحماض الأمينية للبروتينات بشكل فردي عن طريق إدخال مختلف بنيات الجينات في الفئران التي طرقت الجينات المعنية بها. علاوة على ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها في أي سلالة الماوس.
يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران مع التركيز على الجوانب الفنية اللازمة لتحقيق النجاح ترنسفكأيشن: غرز الإبرة الصحيح في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. ويتجلى في تطبيق هذا الأسلوب في نموذج الفأر من داء المثقبيات الأفريقي، وهو مرض قاتل للبشر والماشية 29، 30. بينما عدة أنواع من المثقبيات يسبب مرض في الماشية، ومعظم لا يمكن أن تسبب المرض لدى البشر بسبب المركبات المناعية الفطرية في بlood تسمى عوامل التحللي المثقبيات (TLFs) 29، 31، 32. تشكيل هذه المسام، والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) تحتوي على اثنين فريدة من نوعها، الرئيسيات محددة البروتينات: HPR، يجند، مما يسهل امتصاص TLFs في المثقبيات، وAPOL-I، المكون التحللي 31، 33-38 المثقبية البروسية الروديسية قادر على إصابة البشر بسبب التعبير عن المقاومة المرتبطة البروتين مصل (SRA) التي تربط لويحيد الإنسان APOL-I 34، 39. لم يتم تحييد البابون TLF بواسطة حساب الاحتياطي الخاص نظرا لاختلاف APOL-I البروتين 40. كما ذكرت سابقا، وذلك باستخدام ناقلات التعبير الثدييات (pRG977)، والتعبير المعدلة وراثيا من البابون مكونات TLF في الفئران تمنح حماية ضد المثقبيات للعدوى الإنسان 40. إظهار بيانات تمثيلية المقدمة هنا كيف يمكن تطبيق إيصال الجينات الهيدروديناميكية لدراسة الآثار العلاجية للبروتين.
عندما يقوم بشكل صحيح، HGD هو وسيلة آمنة وفعالة بشكل ملحوظ التسليم التحوير. الخطوات الحاسمة لنجاح HGD هي: 1) تسليم كمية مناسبة من الحمض النووي في كمية كبيرة من المركبات المالحة 2) في الوريد ذيل الفأر 3) في أقل من 8 ثوان.
على الرغم من أن عمل…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ليو شيا (Regeneron صيدلة) ليعلمنا هذا الأسلوب في البداية HGD والدكتور راسيل طومسون (كلية ألبرت اينشتاين للطب) للتوجيه المستمر له في مختلف جوانب التكنولوجيا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية هانتر، جامعة مدينة نيويورك بدء الأموال والجائزة NSF الخبز IOS-1249166. نشكر NYULMC التشريح المرضي مركز كور NYUCI دعم غرانت، المعاهد الوطنية للصحة / NCI 5 P30CA16087-31 لالأنسجة في كبد الفأر.
Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |