Forbigående ekspression af proteiner ved Hydrodynamisk Gene Delivery i mus

Summary

In vivo transfektion af nøgent DNA ved hydrodynamisk genlevering indføres gener i væv i et dyr med minimal inflammatorisk reaktion. Genereres tilstrækkelige mængder af gen-produkt, således at gen-funktion og regulering samt proteiners struktur og funktion kan analyseres.

Abstract

Effektiv ekspression af transgener in vivo er af afgørende betydning i at studere genfunktioner og udvikle behandlinger for sygdomme. Gennem de seneste år har hydrodynamisk gen levering (HGD) dukket op som en enkel, hurtig, sikker og effektiv metode til at levere transgener i gnavere. Denne teknik er baseret på den kraft, der genereres af hurtig injektion af et stort volumen af ​​fysiologisk opløsning for at forøge permeabiliteten af ​​cellemembraner i perfunderede organer, og levere DNA i celler. En af de vigtigste fordele ved HGD er evnen til at indføre transgener i mammale celler ved anvendelse af nøgent plasmid-DNA (pDNA). Indførelse af et eksogent gen ved hjælp af en plasmid er minimalt besværlig, højeffektive og i modsætning til virale bærere bemærkelsesværdigt sikker. HGD blev oprindeligt anvendt til at levere gener ind i mus, er det nu anvendes til at levere en lang række stoffer, herunder oligonukleotider, kunstige kromosomer, RNA, proteiner og små molekyler til mus, rotterog i et begrænset omfang, andre dyr. Denne protokol beskriver HGD i mus og fokuserer på tre centrale aspekter af den metode, der er afgørende for at udføre proceduren med succes: korrekt isætning af nålen i venen, mængden af ​​indsprøjtning og hastigheden af ​​leverancen. Eksempler er givet for at vise anvendelsen af ​​denne fremgangsmåde til transient ekspression af to gener, der koder secernerede, primat-specifikke proteiner, apolipoprotein LI (APOL-I) og haptoglobin-beslægtet protein (HPR).

Introduction

Siden sin første beskrivelse af Liu et al. Og Zhang et al. Har hydrodynamisk gen levering (HGD) blevet et uvurderligt værktøj til at studere genfunktion i gnaver modelsystemer ^{1, 2.} Teknikken involverer hurtig injektion (5-7 sek), i en stor mængde (8-12% af kropsvægten) opløsning i halevenen af mus for at fremme anvendelsen af plasmid-DNA af cellerne i målorganer ^{1, 2.} Disse betingelser fører til robust genekspression i leveren og mindre genekspression i nyrer, milt, lunge og hjerte.

Injektion af 10 ug pCMV-LacZ plasmid kan transficere så meget som 40% af hepatocytter, hvilket HGD de mest effektive, non-viral, in vivo-genafgivelse metode til dato ^1. I modsætning til virale bærere, er pDNA nemt at forberede, ikke fremkalde et immunrespons hos gnavere vært ³ og ikke udgør en sundhedsmæssig risiko ved rekombinerer med udgangeneksogen vira. Hertil kommer, da DNA-molekyler, der leveres af HGD ikke behøver emballage, denne metode er egnet til levering af bakterielle kunstige kromosomer (AKB) så store som 150 kb ^4. Andre typer af molekyler, der er blevet leveret af en hydrodynamisk metode omfatter RNA ^5-10, morpholinos ^11, proteiner ^{12, 13} og andre små molekyler ^{12, 14.} De fordele og ulemper ved HGD end andre formidlingsmetoder er blevet drøftet i fremragende anmeldelser i litteraturen ^15-20 og en række forfattere har givet en detaljeret beskrivelse af proceduren ^21-23.

Introduktion transgener i mus ved HGD er sikker og effektiv ^{1-3, 24} og metoden har været anvendt i rotter med tilsvarende succes ^25. Med visse ændringer, har proof-of-concept forsøg udført i kyllinger ^26, Rabbit ²⁷ og svin ^28, selv om in vivo-anvendelsen af denne teknik i større dyr fortsat en udfordring. Når denne metode anvendes, en anden almindelig begrænsning er, at mange af de tilgængelige mammale ekspressionsvektorer mangler komponenter for at opnå en vedvarende højt niveau af genekspression. Ved hjælp af en pCMV-Luc plasmid, genekspression i målorganer er tydelig så tidligt som ti minutter efter HGD dog den første, højekspressions niveau falder kraftigt i den første uge efter injektion ^1. Langsigtet transgenekspression er muligt, afhængigt af promotoren og intron anvendes i plasmid design ^{3, 24} dog, vedligeholdelse af højt niveau genekspression ofte kræver gentagne injektioner. Af denne grund, kan HGD være mindre egnet til at studere kroniske sygdomme, der er et resultat af langvarig udsættelse for skadelige proteiner eller protein produkter. Med disse begrænsninger, HGD er en usædvanlig kraftfuldt værktøj til at studere potielle rolle af et gen og virkningen af det mutanter in vivo, samt terapeutiske virkninger og regulering af proteiner og til etablering af dyremodeller for sygdommen (for gennemgang, se ^15). For eksempel kan HGD bruges til at tildele funktion domæner og aminosyrer i proteiner ved individuelt at indføre forskellige genkonstruktioner i mus, der har de respektive gener slået ud. Desuden kan denne teknik anvendes i ethvert musestamme.

Denne protokol beskriver HGD i mus med fokus på de tekniske aspekter, der er nødvendige for at opnå en vellykket transfektion: korrekt nål indsættelse i vene, injektionsvolumen og hurtig levering på. Anvendelsen af denne metode er demonstreret i en musemodel af afrikansk trypanosomiasis, en dødelig sygdom for mennesker og husdyr ^{29, 30.} Mens flere arter af trypanosomer forårsage sygdom hos husdyr, kan de fleste ikke forårsage sygdom hos mennesker på grund af medfødte immunforsvar komplekser ibLood kaldet trypanosominfektion lytiske faktorer (TLFs) ^{29, 31, 32.} Disse pore-dannende, high-density lipoprotein (HDL) indeholder to unikke, primat-specifikke proteiner:. HPR, den ligand, hvilket letter optagelsen af TLFs ind trypanosomer og APOL-I, den lytiske komponent ^{31, 33-38} Trypanosoma brucei rhodesiense er i stand til at inficere mennesker på grund udtryk for en serum modstand-associeret protein (SRA), som binder til og neutraliserer human APOL-I ^{34, 39.} Baboon TLF ikke neutraliseret af SRA grund af sin divergerende APOL-I-protein ^40. Som rapporteret tidligere, ved hjælp af en mammal ekspressionsvektor (pRG977), transgen ekspression af bavian TLF komponenter i mus giver beskyttelse mod humane infektionssygdomme trypanosomer ^40. De repræsentative data, der præsenteres her viser, hvordan hydrodynamisk genafgivelse kan anvendes til at undersøge de terapeutiske virkninger af et protein.

Protocol

Alle eksperimenter er beskrevet her blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Hunter College, City University of New York. 1. Fremstilling af endotoksin-frit plasmid-DNA Pick en enkelt koloni af bakterier indeholdende genet af interesse i en mammal ekspressionsvektor fra en frisk udstrøget selektiv plade. Følg anbefalingerne i håndbogen af ​​en kommercielt tilgængelig endotoksinfri plasmidoprensningsproces kit til dyrkning og høst bakterier. </li…

Representative Results

Korrekt placering af nålen i halevenen af mus (som illustreret i figur 1) er en forudsætning for en vellykket levering af et transgen af hydrodynamik baseret transfektion. Ofte den mest udfordrende del af teknikken er imidlertid fastholdelse af nålen i halevenen uden bevægelse, således at hele mængden af ​​injektionen kan leveres inden for 6-8 s periode. Mindre fejl under injektion kan resultere i stærkt reduceret transfektionseffektivitet og proteinekspression. Derfor er det bydende nødvend…

Discussion

Når de udføres korrekt, HGD er et bemærkelsesværdigt sikker og effektiv middel til transgen levering. De kritiske trin til vellykket HGD er: 1) at levere den rigtige mængde af DNA i et stort volumen saltvand køretøjet 2) i halevenen på musen 3) på mindre end 8 sekunder.

Selv om processen med selve injektionen unægtelig kræver nogle håndelag, succesen af ​​denne seks-anden procedure ofte ligger i omhyggelig forberedelse af forsøget. Mængden af ​​pDNA nødvendig for at op…

Materials

Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD