在小鼠肾切除术后建立自发性转移性肾细胞癌（mRCC）模型

摘要

自发性转移性肾细胞癌（RCC）疾病进展模型可用于在具有临床相关性的环境中评估治疗方法。本实验方案展示了原位肾肿瘤细胞植入、规范的肾切除术操作步骤，最后提供了一套尸检指南，用于对转移负荷及定位进行肉眼观察和生物发光评分。

摘要

在肾细胞癌（RCC）新实验性治疗药物的改进测试中，一个关键挑战是建立能够真实模拟早期和晚期转移性疾病的进展模型。典型的肿瘤移植模型通常采用异位或原位的原发性肿瘤植入，但很少包含能够模拟临床情况的全身性自发转移性疾病。本实验方案描述了构建与患者疾病进展阶段相似的RCC模型的关键步骤。首先，该方案采用高转移性的小鼠肿瘤细胞系，在同源模型中实现原位肿瘤细胞植入，方法包括将细胞与Matrigel混合后植入肾包膜下空间，以防止细胞泄漏和早期扩散，该操作既可经浅表途径也可经内部途径进行。接着，方案详细说明了带瘤肾脏切除（肾切除术）的操作流程，并强调了术前和术后小鼠护理的关键要点。最后，方案概述了监测和评估微转移及大转移疾病进展所必需的步骤，包括生物发光成像，并提供了一份详细的可视化尸检指南，用于评分全身性疾病的分布情况。本方案的目标是促进临床相关性高的转移性RCC模型的广泛应用，从而提高未来治疗测试的预测价值。 

引言

肾细胞癌（RCC）患者死亡的主要原因是全身性转移性疾病，这类转移通常在肾脏原发肿瘤经手术切除后发生。然而，目前在小鼠中评估实验性治疗手段的临床前肿瘤模型极少包含转移性疾病，能够真实模拟局部生长、手术切除以及自发性微转移形成与进展等临床阶段的模型更是少之又少 ^1-3。随着新疗法的不断涌现，这一测试环节的缺失变得愈发重要，因为在动物模型中观察到的显著抗肿瘤效果并不总能转化为对患者的同样成功治疗 ⁴。这种结果差异可能源于局部异位或原位原发肿瘤模型与晚期转移性疾病之间药物疗效的不同^5-7。以肾细胞癌为例，仅有少数研究采用了包含自发性复发疾病的成熟动物实验方案，而这类复发情况可模拟临床上通常已将带瘤肾脏完全或部分切除的患者状况 ^2,3。造成小鼠模型应用不足的原因多种多样。首先，动物成本高昂，且肿瘤细胞的选择及其转移潜能存在固有的变异性。例如，人类肾癌细胞系通常极少发生转移，必须经过多轮原位植入和转移性筛选，才能获得能够稳定播散并形成远端病灶的亚系（参见此类人类细胞系建立过程的描述 ^8-10）。相反地 ，在免疫健全小鼠模型中，小鼠来源的肿瘤细胞往往表现出较强的侵袭性，因此必须使用较低细胞数量并联合Matrigel注射，以减少立即发生的全身扩散³。其次，实施准确的原位植入、手术切除（肾切除术）以及对自发性转移生长进行追踪（和定量）存在技术上的困难，在应用该技术时需考....

方案

1. 原位肾肿瘤移植

1. 细胞培养
   1. 在进行原位移植前，将小鼠 RENCA^LUC 细胞以单层培养至 75% 汇合度。
   2. 经胰酶消化并用含 5% FBS 的培养基重悬后，在 4 °C 条件下以 1,000 rpm 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤 3 次。然后将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为 5 × 10⁴ RENCA^LUC/5 μl 无血清培养基。
      注意：根据所使用的细胞变体或细胞系，可将细胞重悬于基质胶（matrigel）与无血清培养基按 1:1 比例混合的溶液中，以减缓高侵袭性小鼠细胞在移植后的生长和扩散。
2. 手术与细胞移植
   注意：本文所述所有动物实验，包括动物饲养管理及实验终点的确定，均依照罗斯韦尔帕克癌症研究所（Roswell Park Cancer Institute）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
   1. 使用异氟烷（2–3%）麻醉一只 Balb/C 小鼠。轻捏足部并检查反射以确认麻醉充分。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于右侧卧位，剃除前肢与后肢之间左侧体表的毛发。用酒精和碘酒对背部腰部区域进行消毒，为切口做好无菌准备。
   2. 使用手术剪在最后一根肋骨与髋关节之间沿纵轴方向做一条约 1 cm 的皮肤切....

结果

图1A 展示了本方案摘要中详细说明的操作流程示意图。每一步骤均需考虑若干重要因素。例如，在步骤1中，展示了将肿瘤细胞植入肾脏包膜下的两种方法。可通过产生微小白色气泡来确认肿瘤细胞被准确地定位于包膜下间隙，同时在拔出针头后小心擦拭溢出的液体，以防止泄漏（图1B-i）。为防止泄漏，也可先将细胞植入肾实质内部，使其进入包膜下空间（图1B-ii），并可与Matrigel混合使用，以阻止肿瘤细胞过早进入血液循环。关于肾脏的手术切除，具体时间取决于所用细胞系的生长速度和转移潜能。最佳的肾切除操作应快速但可控，以尽量减少小鼠的痛苦并促进恢复。使用Vicryl线牢固结扎输尿管、肾动脉和肾静脉是防止出血的关键（见图1C）。可使用电灼止血，但仅在可能出现大量出血时才进行干预。最后，通过非侵入性生物发光检测对自发性疾病进行追踪，可实现对隐匿性病灶及其生长的持续监测，并在实验终点进行定量分析（见图1D）。然而，在自发性转移模型中使用荧光素酶标记的细胞时，有时会导致克隆性肿瘤细胞筛选出不表达转染.......

讨论

本实验方案的目的是利用同源肿瘤小鼠模型评估具有临床相关性的自发性转移性疾病，并描述肿瘤植入和切除的技术。目前，大多数评估新型实验性治疗手段的临床前研究并未纳入对转移性疾病的考察，仅有少数研究能够重现原发肿瘤生长、手术切除以及最终自发性转移扩散的各个阶段。迄今为止，为诱导自发性肾细胞疾病进展而构建的基因工程小鼠模型（GEMMs）（详见¹⁴的综述）尚不包括晚期转移阶段，且尚未见报道有关这些模型的外科干预策略。因此，目前自发性转移性肾细胞癌（RCC）的研究仅限于原位肿瘤细胞植入模型。尽管此类模型已有先前的建立 ^2,3，但该方案在新疗法评估中尚未被广泛应用，尤其是在围手术期治疗评估中，其可能具有最高的预测价值。本方案旨在详细阐述必要的操作步骤，以促进该模型在治疗评估中的更广泛使用。在执行本方案所述技术时可能存在若干潜在问题，需特别注意几个关键因素，这些因素可能影响实验结果。首先，肿瘤细胞植入后发生泄漏可能导致腹膜内疾病播散，从而无法代表初始的局部原发性肿瘤生长。其次，必须针对所使用的每种细胞系确定最佳切除时间。这一点至关重要，因为过早地对荷瘤肾脏进行手术肾切除可能不足以引发疾病转移（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM-高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺	康宁	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% 胰蛋白酶 EDTA	康宁	25-053-CL
不含钙的1x DPBS &和镁	康宁	21-031-CV
Matrigel	BD 生物科学	354234	必须保持在冰上
人工泪液-润滑性眼膏	Akorn动物健康	17478-162-35
口袋式宠物修剪器	布雷因特里科学公司	CLP9931B
酒精棉片	VWR	326895
聚维酮碘溶液棉签	VWR	67618-152-01
直头微解剖剪，钝头 - 25 mm 刀片 - 4.5"	南点外科手术	RS-5982
虹膜镊，带齿，弯曲型，10 cm 长	Kent scientific	INS15915	需要两个这样的
10 µ10 微升汉密尔顿注射器	Hamilton	7635-01
30 G，45度，RN针头	Hamilton	7803-07
无菌棉签	VWR	10805-144
高温电烙器套件	Kent scientific	INS500392
5-0 涂层薇乔线，普通切割针	Ethicon	J834
7 mm 结扎夹自动施夹器	Kent scientific	INS500343
反射夹，7 mm，非无菌	Kent scientific	INS500344
移除镊子，12 cm 长	Kent scientific	INS500347
0.9% 氯化钠	Baxter Healthcare	2B1322
布托啡诺 0.01 mg/ml
25 G 5/8" 针	VWR	BD305122
1 ml 无针注射器	VWR	BD309659
D-荧光素	Gold Bio technology	LUCK-1G