Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

Daniel T. Claiborne; Jessica L. Prince; Eric Hunter

doi:10.3791/51506

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la

15.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/51506

⸱

31 août 2014

Daniel T. Claiborne^*¹ , Jessica L. Prince^*¹ , Eric Hunter¹^,²

¹Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Résumé

L’effet protecteur de nombreux allèles HLA de classe I sur la pathogenèse du VIH-1 et la progression de la maladie est, en partie, attribué à leur capacité à cibler les parties conservées du génome du VIH-1 qui s’échappent difficilement. Les changements de séquence attribués à la pression immunitaire cellulaire se produisent dans tout le génome pendant l’infection et, s’ils sont trouvés dans des régions conservées du génome telles que Gag, peuvent affecter la capacité du virus à se répliquer in vitro. La transmission de polymorphismes liés à HLA chez Gag à des receveurs non appariés HLA a été associée à une réduction des charges virales de consigne. Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être dû à une capacité de réplication réduite du virus. Nous présentons ici une nouvelle méthode d’évaluation de la réplication in vitro du VIH-1 influencée par le gène gag isolé à partir de points temporels aigus chez des Zambiens infectés par le sous-type C. Cette méthode utilise le clonage basé sur l’enzyme de restriction pour insérer le gène gag dans un squelette proviral commun du VIH-1 de sous-type C, MJ4. Cela le rend plus approprié pour l’étude des séquences de sous-type C que les méthodes précédentes basées sur la recombinaison qui ont évalué la réplication in vitro de séquences gag-pro dérivées de manière chronique. Néanmoins, le protocole pourrait être facilement modifié pour l’étude de virus d’autres sous-types. De plus, ce protocole détaille une méthode robuste et reproductible pour évaluer la capacité de réplication des virus chimériques Gag-MJ4 sur une lignée de cellules T à base de CEM. Cette méthode a été utilisée pour l’étude des virus chimériques Gag-MJ4 dérivés de 149 Zambiens gravement infectés de sous-type C, et a permis d’identifier les résidus dans Gag qui affectent la réplication. Plus important encore, la mise en œuvre de cette technique a permis de mieux comprendre comment la réplication virale définit les paramètres de la pathogenèse précoce du VIH-1, tels que la charge virale au point de consigne et le déclin longitudinal des lymphocytes T CD4+.

Introduction

Déterminer à la fois l'hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l'hôte d'établir un état stable (point de consigne) de la charge virale ^{de 1,2.} Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral ^3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l'i....