マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成
1Department of Mechanical Engineering,University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering,University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology,The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering,University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division,Lawrence Berkeley National Laboratory
Summary
液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。
Abstract
ボトムアップ合成生物学は、潜在的に生化学系と、最小限の生物を調査し、再構成するための新しいアプローチを提示します。この新興分野は、下から上に複雑な、機能してシステムへの基本的な生物学的なコンポーネントを設計し、組み立てる技術者、化学者、生物学者、物理学者を行っています。このようなボトムアップのシステムは、基本的な生物学的問い合わせや、革新的な治療法1,2人工細胞の開発につながる可能性があります。巨大単層小胞（GUVs）は、それらの細胞様膜構造とサイズに合成生物学のためのモデルのプラットフォームとして機能することができます。マイクロ流体吐出、又はmicrojettingは、制御された大きさ、膜組成、膜貫通タンパク質の取り込み、およびカプセル3を有するGUVsの生成を可能にする技術である。この方法の基本原理は、懸濁リットル変形するピエゾ作動式インクジェット装置によって生成された複数の高周波流体パルスの使用であるGUVに重層をIPID。プロセスは、石鹸膜でシャボン玉を吹くに似ています。噴出液、包含する溶液の組成、および/または成分の組成を変化させることによって二重層に含まれる、研究者は、カスタマイズされた小胞を作成するためにこの技術を適用することができる。本稿ではmicrojettingにより液滴界面二重層から簡単な小胞を生成するための手順について説明します。
Introduction
これは、細胞生物学の分子から細胞への我々の理解を統合することが含まマルチスケール問題であることがますます明らかになってきた。その結果、分子が個別に動作し、正確にどのように知ることは複雑な細胞の挙動を理解するには十分ではない。これは、5を抽出するアフリカツメガエルにおける脂質二重層小胞4、紡錘体とアクチンネットワーク相互作用の再構成によって例示されるように、部分的には多成分系の射出挙動の存在であり、細菌の細胞分裂機械6の空間的なダイナミックス。生体系の分子プロセスを解剖の還元主義のアプローチを補完する一つの方法は、生物学的要素の最小セットを使用して細胞挙動を再構成する逆のアプローチを取ることです。このアプローチの重要な部分は、限られた量の生体分子の信頼性の高いカプセル化、細胞の重要な機能が含まれます。
e_contentは">いくつかの戦略は、バイオミメティックシステムを研究するための生体分子をカプセル化するために存在する。最も生物学的に関連システムは、細胞の細胞質膜によって課される生化学的および物理的な制約を模倣する脂質二重膜、である。電鋳7による巨大単層小胞（GUVs）の形成、精製タンパク質を操作するための問題である可能性がありGUV世代14のために最も広く使用される技術の一つは、通常、高塩緩衝液8との互換性がないため不十分な封入収率を持っています。電鋳でも大量の試料を必要とする（> 100μL）、 、および非効率的に近接した脂質層の間の拡散の困難さに起因する大きな分子を組み込んでいる脂質小胞を生成するためのいくつかのマイクロ流体アプローチが開発されている。層を水 – 油 – 水との間の2つのインターフェイスを介して構成要素を通過するダブルエマルション法を、（W / O / W）、Voの蒸発に依存しています脂質二重層の形成9を駆動するlatile溶媒。他のものは脂質二重層小胞10または二つの独立したステップ11での連続的なストリームを生成するマイクロ流体組立ラインを使用している。我々は、急速に制御されたサイズ、組成、およびカプセル化のGUVsを生成するために液滴界面二重層12に流体パルスを印加することに基づいて、代替技術を開発した。マイクロ流体噴射として知られている我々のアプローチは、生物学的な様々な問題を調査するための機能的な生体分子システムを作成するためのアプローチを提供し、いくつかの既存の小胞生成技術の組み合わせの利点があります。Protocol
1。無限チャンバー製作コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して（その形状にちなんで命名）無限室を設計し、それがレーザーカッターと互換性があるように、ファイルを保存します。レーザーカッターで透明なアクリルで1/8- 3月16日からチャンバをカット0.15インチの中心間距離でこの形状、直径0.183の別々の二つの円を作成します。無限の形状は、液滴界面二?…
Representative Results
私たちは、機械加工部品や手動マイクロメートルから組み立てたカスタムステージ（ 図1）と、従来の倒立蛍光顕微鏡でミクロ流体噴射セットアップを組み立てています。インクジェットの特性評価は、小胞の生成プロセスへの洞察を提供します。インクジェットノズルと脂質二重層との間の距離を変化させることにより、力が膜の変形を生じさせるために適用影響を及ぼす。二…
Discussion
多くの技術が電鋳、エマルション、液滴発生14-16を含む、小胞の生成のために開発されている。ただし、新しい実験技術は、生体系に成長して類似性を有する生物学的システムの設計を可能にするために必要です。特にマイクロ流体の方法は近い生物学にベシクルモデルをもたらし、膜unilamellarity、サイズの単分散性、および内部のコンテンツ17,18を管理するコントロールのレ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はmicrojettingパラメータに関するアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のフレッチャー研究室からマイクVaheyに感謝します。この作品は、NIHの助成金DP2 HL117748-01が主催した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
Cite This Article
Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).