जीन एक्सप्रेशन के सभी चरणों में वायरल फंक्शन बढ़ाता के लिए चेचक रिपोर्टर वायरस
Summary
हम प्रेतसंबंधी अलग संवाददाता fluorophores के मंच विशिष्ट अभिव्यक्ति के माध्यम से वायरल संक्रामकता और जीन अभिव्यक्ति की वास्तविक समय माप सक्षम बनाता है एक फ्लोरोसेंट संवाददाता चेचक वायरस के उपयोग का वर्णन. हम विस्तार सही वायरस प्रतिकृति छोटे अणु अवरोध के जवाब में प्रभावित होता है, जिस पर मंच की पहचान करने के लिए एक प्लेट आधारित विधि.
Abstract
Poxviruses सक्रिय मानव ऐसे monkeypox के रूप में रोगजनकों, कोमलार्बुद contagiousum, और Contagalo वायरस शामिल है कि डबल असहाय डीएनए वायरस का एक परिवार है. परिवार भी चेचक वायरस, शीतला शामिल हैं. कारण poxvirus प्रतिकृति की जटिलता के कारण, कई सवाल अभी भी उनके जीन अभिव्यक्ति की रणनीति के बारे में रहते हैं. इस लेख में हम एक उच्च throughput प्रारूप में वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक और कई चरणों की वास्तविक समय की माप है कि सक्षम पुनः संयोजक चेचक वायरस की अवधारणा और उपयोग का वर्णन. इस वायरल प्रतिकृति के तीन चरणों में से प्रत्येक के लिए संवाददाताओं के रूप में प्रेतसंबंधी अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के माध्यम से सक्षम है. मंच विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न, सक्रिय करने के प्लेट आधारित assays और वायरस प्रचार और नकल की सूक्ष्म टिप्पणियों को बनाए रखना है, जबकि ये वायरस एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करते हैं. ये उपकरण एंटीवायरल खोज, वायरस मेजबान बातचीत का अध्ययन, और विकासवादी जैव के लिए उपयोग करता हैसना हुआ.
Introduction
परंपरागत रूप से, वायरस अभिव्यक्ति आणविक जीव विज्ञान तकनीक (जैसे उत्तरी सोख्ता, पश्चिमी सोख्ता, माइक्रोएरे संकरण, आदि) 1 का उपयोग का अध्ययन किया जाता है. इन तरीकों व्यक्ति mRNAs या प्रोटीन की अभिव्यक्ति परिवर्तन के वर्गीकरण के संबंध में विस्तृत जानकारी प्रदान करने में सक्षम हो रहे हैं, वे आम तौर पर वास्तविक समय और उच्च throughput प्रक्रियाओं के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. Poxviruses साथ कार्य करते समय प्रतिदीप्ति आधारित संवाददाताओं का उपयोग वैकल्पिक तरीकों पहले से लागू किया गया है; हालांकि, उनके विकास और उपयोग के विभिन्न उद्देश्य से प्रेरित किया गया है. कई ऐसे तरीकों पुनः संयोजक वायरस 2,3 के चयन के लिए डिजाइन किए गए थे. इन तकनीकों में उचित समावेश और पुनः संयोजक चेचक क्लोन से एक्सोजेनस डीएनए की अभिव्यक्ति पर EGFP व्यक्त करते हैं. इसी तरह, कई चेचक उपभेदों stably घुलनशील EGFP व्यक्त या एक देशी चेचक प्रमोटर के तहत व्यक्त GFP टैग प्रोटीन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है. ये typ हैंically वायरस प्रवेश और प्रतिकृति एंटीबॉडी आधारित निराकरण assays के दौरान, रासायनिक अवरोध, या antiviral प्रभाव को 4-6 की तुलना यों इस्तेमाल किया. इन वायरस उपयोगी साबित हुए हैं, वे कारण एक भी अस्पष्ट देर / जल्दी वायरल प्रमोटर के अपने उपयोग के लिए निषेध की बात के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं. पिछले विधियों भी suboptimal संकेत करने वाली शोर विशेषताओं के साथ EGFP प्रोटीन का इस्तेमाल किया है.
कारण poxvirus प्रतिकृति और वायरल जीन अभिव्यक्ति में वास्तविक समय में परिवर्तन परख उपलब्ध मौजूदा उपकरणों की कमी की जटिलता के कारण, हम एकल और बहु मंच संवाददाता वायरस 7,8 के एक कमरे का विकास किया है. पिछले प्रकाशनों में वर्णित है, इन वायरस, जल्दी संक्रमण में मध्यवर्ती, या देर चरणों के दौरान एक, दो, या देशी चेचक प्रमोटरों से तीन प्रेतसंबंधी अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं. ये वायरस हमें हो सकता हैएक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग वायरस प्रतिकृति प्रगति के संकेतक के रूप में एड और वे उच्च throughput प्लेट और पाठक आधारित assays के लिए समान रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. ये वायरस बराबर titers 7 तक पहुँचने के लिए इसी तरह कैनेटीक्स के साथ बढ़ रही है, जंगली प्रकार के वायरस के स्थान पर प्रयोग करने में आसान हैं. योजना और इन वायरस के निर्माण के दौरान, बहुत देखभाल अभिव्यक्ति (वीनस, mCherry और TagBFP) में परिवर्तन करने के लिए तेजी से प्रतिक्रिया के साथ विश्वसनीय मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए बेहतर तह दक्षता के साथ उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि विशेषताओं है कि fluorophores के चयन में लिया गया था. इसके अतिरिक्त, वायरल प्रमोटरों के संयोजन अस्पष्ट के विपरीत, उच्च निष्ठा, स्पष्ट चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति, (C11R प्रमोटर) जल्दी की पूरी रेंज के बारे में जानकारी प्रदान करने, मध्यवर्ती (G8R प्रमोटर) और देर से (F17R प्रमोटर) जीन अभिव्यक्ति का उत्पादन जो चुने गए जल्दी / देर प्रमोटरों.
ये वायरस inve के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैआद्य poxvirus, चेचक वायरस के जीवन चक्र stigating. ज्यादातर अध्ययन के अपने लंबे इतिहास के बावजूद अभी भी मेजबान वायरस बातचीत के बारे में ज्ञात नहीं है. चेचक immunomodulatory हैं और विरोधी की मेजबानी जिनमें से कई की 200 से अधिक अद्वितीय प्रोटीन, उत्पादन, जटिल है. संक्रमण पर, चेचक वायरस तुरंत जल्दी mRNA प्रतिलेखन शुरू होता है. इस virion पैकेजिंग के दौरान वायरल जीनोम पर लोड और बाद में संक्रमण जब तक एक रुका हुआ राज्य में आयोजित की गई है कि एक शाही सेना पोलीमरेज़ और प्रतिलेखन कारक से मदद की है. यह जल्दी अभिव्यक्ति मुख्य रूप से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली (mRNA decapping, dsRNA ज़ब्ती, और प्रलोभन रिसेप्टर प्रोटीन के साथ ही apoptosis की inhibitors, तनाव प्रतिक्रिया, और टोल, आईएल, और NF-κB संकेतन) और जीनोम प्रतिकृति के दमन के लिए आवश्यक प्रोटीन पैदा करता है. प्रारंभिक अभिव्यक्ति भी मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारक पैदा करता है. इंटरमीडिएट अभिव्यक्ति देर चरण प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति भी शामिल है. यहअभिव्यक्ति झरना परिपक्व चेचक virion की पूरी विधानसभा के लिए आवश्यक हैं जो संक्रमण की देर चरणों के दौरान संरचनात्मक और enzymatic वायरस प्रोटीन के उत्पादन की ओर जाता है.
फ्लोरोसेंट संवाददाता वायरस के हमारे सेट poxvirus जीव विज्ञान की समझ में किए जाने के लिए तेजी से प्रगति के लिए अनुमति देता है. विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में सबसे आम है और समय लेने वाली विधियों में से एक विकास परख है. यह आम तौर पर, कोशिकाओं को संक्रमित संक्रमित कोशिकाओं lysing द्वारा उपचार, फसल कटाई के वायरस की एक श्रृंखला अभिनीत, और पट्टिका परख द्वारा परिणामस्वरूप वायरल अनुमापांक बढ़ाता शामिल है. यहाँ वर्णित संवाददाता वायरस का उपयोग आसानी से assayed और समानांतर में प्रदर्शन के लिए कई उपचार के बीच तुलना की जा सकती है कि वायरस के विकास की वास्तविक समय माप की अनुमति देता है. हम अभिकर्मकों के इस सेट दवा उपचार, आरएनएआई कश्मीर के जवाब में वायरल जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा उम्मीदnockdown, या मेजबान रेंज प्रतिबंध.
यह विधि भी ब्याज की विशेष रूप से परिभाषित लक्ष्य के चरणों के लिए उच्च throughput विरोधी वायरल दवा स्क्रीन के लिए अनुमति देता है, पहले से उपलब्ध की तुलना में एक बड़े पैमाने पर उच्च सामग्री विश्लेषण में सक्षम बनाता है. Poxvirus संक्रमण का मुकाबला करने के लिए कई संभावित उपचार पहचान की गई है, केवल एफडीए poxvirus संक्रमण के इलाज के लिए प्रभावी उपचार अचक्रीय phosphonate न्यूक्लीओसाइड, cidofovir, और चेचक प्रतिरक्षा ग्लोब्युलिन 9,10 के साथ इलाज कर रहे हैं मंजूरी दे दी. 1977 11 में चेचक के उन्मूलन के बावजूद, poxviruses मानव स्वास्थ्य 12 के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा बने हुए हैं. शीतला वायरस के खिलाफ बड़े पैमाने पर टीकाकरण की समाप्ति के अन्य poxviruses 13 के लिए बढ़ा संवेदनशीलता के लिए प्रेरित किया. उदाहरण के लिए, पहले से टीकाकरण द्वारा संरक्षित मध्य अफ्रीका के क्षेत्रों monkeypox वायरस के संक्रमण के 14 में वृद्धि का सामना कर रहे हैं. महत्वपूर्ण चिंता का विषय भी कर दिया गया हैशीतला वायरस की जानबूझकर रिलीज करने के लिए अव्यक्त संवेदनशीलता के बारे में उठाया. कारण वर्तमान में उपलब्ध सीमित उपचार के लिए उपन्यास उपचार के विकास के लिए एक तत्काल आवश्यकता है. ये संवाददाता वायरस वायरल प्रतिकृति के एक विशिष्ट चरण के निषेध के लिए तेजी से और उच्च throughput छोटे अणु अवरोध करनेवाला स्क्रीनिंग अनुमति देते हैं. निषेध का फिलहाल नहीं लक्ष्य वायरल अभिव्यक्ति चरणों inhibitors कि लक्ष्य की पहचान में वृद्धि हुई शक्ति के साथ संयोजन के उपचारों के विकास की सुविधा होगी.
ज्यादा प्रत्येक चरण के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन देख द्वारा चेचक कोशिका जीव विज्ञान के बारे में बटोरा जा सकता है. रासायनिक या एक संक्रमित मेजबान सेल की आनुवंशिक हेरफेर से क्षीणन आम तौर पर कम वायरल titers के संदर्भ में व्यक्त किया जाता है. हालांकि, वायरल अभिव्यक्ति झरना के प्रत्येक चरण में परिवर्तन की तुलना करके, एक वायरस फिटनेस प्रभाव है कि कैसे की एक और पूरी समझ प्राप्त कर सकते हैंएक विशेष उपचार द्वारा एड. ये आंकड़े पारंपरिक वायरस टिटर उत्पादन के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी, लेकिन और अधिक विस्तृत यंत्रवत जानकारी के साथ ही उच्च throughput क्षमताओं 7 प्रदान करने के लिए दिखाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम वायरस नकल की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, वास्तविक समय प्रतिक्रिया उपाय प्रदान करता है जो एक बहुमंज़िला चेचक संवाददाता वायरस (TrpV), के व्यावहारिक उपयोग का वर्णन किया है. अच्छी तरह से परिभाषित p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सेंट-246 प्रदान करने के लिए SIGA टेक्नोलॉजीज (Corvallis, या) धन्यवाद. DKR बोस्टन विश्वविद्यालय (5T32AI 7309) के लिए प्रतिरक्षा विज्ञान में एक NIH प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. इस काम P41 086180 द्वारा समर्थित किया गया था, एनआईएच RO1AI1096159-01, और RO3 (JHC के लिए).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
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