Vaccinia Reporter Vira til kvantificering Viral Funktion på alle stadier af genekspression
Summary
Vi beskriver brugen af en fluorescerende reporter vacciniavirus, der muliggør real-time måling af virusinfektivitet og genekspression igennem etapen-specifikt udtryk for spektralt adskilte reporter fluorophores. Vi detalje en plade-baserede metode til præcist at identificere det stadium, hvor virus replikation påvirkes som reaktion på små molekyle hæmning.
Abstract
Poxviruses er en familie af dobbelt strandede DNA-virus, der indeholder aktive humane patogener såsom monkeypox, molluscum contagiousum og Contagalo virus. Familien omfatter også koppevirus, Variola. På grund af kompleksiteten af poxvirus replikation, mange spørgsmål er stadig om deres genekspression strategi. I denne artikel beskriver vi conceptualization og anvendelse af rekombinante vacciniavira, der muliggør tidstro måling af enkelte og flere stadier af viral genekspression i en high-throughput format. Dette er aktiveret ved anvendelse af spektralt forskellige fluorescerende proteiner som reportere til hver af de tre faser af viral replikation. Disse vira giver en høj signal-til-støj-forhold og samtidig bevare stage specifikke udtryk mønstre, der gør det muligt plade-baserede assays og mikroskopiske observationer af virus formering og replikation. Disse værktøjer har anvendelsesmuligheder for antiviral opdagelse, undersøgelser af interaktionen virus-vært, og evolutionære biologi.
Introduction
Traditionelt er virus udtryk undersøgt ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker (fx Northern blotting, Western blotting, microarray hybridisering, osv.) 1. Mens disse metoder er i stand til at give detaljerede oplysninger med hensyn til at kategorisere udtryk ændringer i de enkelte mRNAer eller proteiner, er de typisk ikke modtagelig for real-time og high-throughput processer. Alternative metoder, der anvender fluorescens-baserede journalister er blevet anvendt tidligere, når du arbejder med poxviruses; Imidlertid har deres udvikling og anvendelse er blevet motiveret af forskellige mål. Flere sådanne metoder blev udviklet til udvælgelse af rekombinante vira 2,3. Disse teknikker udtrykker EGFP på korrekt inkorporering og ekspression af exogent DNA fra rekombinante vaccinia kloner. Tilsvarende flere vacciniastammer stabilt udtrykker opløselig EGFP eller GFP-mærkede proteiner udtrykt i en nativ vaccinia-promotor har været meget anvendt. Disse er typtisk bruges til at kvantificere virus indrejse og replikation i løbet af antistofbaserede neutraliseringsassays, kemisk hæmning, eller sammenligning af antiviral effektivitet 4-6. Mens disse vira har vist sig nyttige, er de begrænset i deres evne til at give detaljerede oplysninger om det punkt hæmning på grund af deres brug af et enkelt tvetydig tidlig / sen viral promotor. Tidligere fremgangsmåder har også gjort brug af EGFP protein med suboptimale signal-støj-egenskaber.
På grund af kompleksiteten af poxvirus replikation og manglen på eksisterende værktøjer til rådighed til at analysere real-time ændringer i virusgenekspression, har vi udviklet en suite af single og multi scene reporter vira 7,8. Som beskrevet i tidligere publikationer, disse vira udtrykker et, to eller tre spektralt forskellige fluorescerende proteiner fra native vaccinia promotorer i den tidlige, mellemliggende eller sene stadier i infektion. Disse vira kan være osed som indikatorer for virus replikation fremskridt ved hjælp af en fluorescens mikroskop og de er lige velegnede til high-throughput plade-og-reader assays. Disse vira er let at bruge i stedet for vildtype-virus, der vokser med lignende kinetik for at nå tilsvarende titre 7. Under planlægningen og oprettelsen af disse vira, var meget omhyggelig med at vælge fluorophores der har høje signal-til-baggrund karakteristika med overlegen folde effektivitet til at lette pålidelig kvantificering med hurtig tilbagemelding til ændringer i udtrykket (Venus, mCherry og TagBFP). Derudover blev kombinationer af virale promotorer valgt som producerer high fidelity, entydig trinspecifik udtryk, der giver oplysninger om hele spektret af tidlige (C11R promotor), mellemliggende (G8R promotor) og sene (F17R promotor) genekspression i modsætning til tvetydige tidlig / sen initiativtagere.
Disse vira kan anvendes som et redskab til investigating livscyklus prototypiske poxvirus, vaccinia virus. Meget er stadig ikke kendt om samspillet host-virus på trods af sin lange historie undersøgelsen. Vaccinia er kompleks, der producerer over 200 unikke proteiner, hvoraf mange er immunmodulerende og vært antagonistisk. Efter infektion, vacciniavirus begynder straks tidlig mRNA-transkription. Dette lettes af en RNA-polymerase og transkriptionsfaktorer, der blev indlæst på det virale genom i løbet af virion emballage og holdes i et midlertidigt afbrudt tilstand, indtil efterfølgende infektion. Denne tidlige ekspression producerer proteiner, der kræves til undertrykkelse af værtens immunsystem (mRNA hætteaftagning, dsRNA binding og lokkemad-receptorproteiner samt inhibitorer af apoptose, stress respons, og Toll, IL, og NF-KB-signalering) og genomreplikation. Tidlig udtryk producerer også transkriptionsfaktorer der er nødvendige for mellemliggende udtryk. Intermediate udtryk omfatter ekspression af sene transskription fase faktorer. Detudtryk kaskade fører til produktion af strukturelle og enzymatiske virus proteiner under sene stadier af infektion, som er nødvendige for fuldstændig samling af modne vaccinia virion.
Vores sæt af fluorescerende reporter vira tillader hurtig fremskridt i forståelsen af poxvirus biologi. En af de mest almindelige og tidskrævende metoder inden for virologi er vækstassay. Dette involverer typisk at inficere celler, fastlæggelse af en række behandlinger, høst-virus ved at lysere inficerede celler og kvantificere den resulterende virale titer ved plaque-assay. Brug af reporter virus beskrevet her tillader tidstro måling af virusvækst, der let kan analyseres og sammenlignes mellem mange behandlinger, der udføres parallelt. Vi forudser dette sæt af reagenser vil blive anvendt i forskellige protokoller til at identificere ændringer i viral genekspression som reaktion på lægemiddelbehandling, RNAi knockdown eller værtsspektrum begrænsning.
Denne metode gør det muligt også højt indhold analyse på en større skala end tidligere tilgængelige, giver mulighed for high-throughput antivirale narkotika skærme til specifikt definerede målgrupper stadier af interesse. Mens mange potentielle behandlinger til bekæmpelse af poxvirus-infektion er blevet identificeret, er den eneste FDA-godkendte behandlinger er effektive til behandling af poxvirus-infektion er den acykliske phosphonat nucleosid Cidofovir, og behandling med vaccinia immunglobulin 9,10. På trods af udryddelsen af kopper i 1977 11, koppevira forblive en væsentlig trussel mod menneskers sundhed 12.. Ophør af udbredt vaccination mod Variola virus har ført til øget følsomhed over for andre koppevira 13. For eksempel er områder i Centralafrika tidligere var beskyttet ved vaccination oplever en kraftig stigning i Monkeypox virusinfektioner 14. Betydelig bekymring har også væretfremføres vedrørende latente tilbøjelighed til udsætning af Variola-virus. På grund af de begrænsede behandlinger øjeblikket er til rådighed, er der et presserende behov for udvikling af nye behandlinger. Disse reporter vira tillade hurtig og high-throughput lille molekyle inhibitor screening for hæmning af en bestemt fase af viral replikation. Identifikation af inhibitorer, der er målrettet virusekspressionssystemer etaper i øjeblikket ikke målet for hæmning vil lette udviklingen af kombinationsbehandlinger med øget styrke.
Meget kan udledes om vaccinia cellebiologi ved at observere ændringer i hver etape er genekspression. Dæmpning ved kemisk eller genetisk manipulation af en inficeret værtscelle udtrykkes typisk i form af reducerede virale titere. Men ved at sammenligne ændringer i hver fase af den virale udtryk kaskade, kan man få en mere komplet forståelse af, hvordan virus fitness er virkningened af en bestemt behandling. Disse data har vist sig at korrelere godt med den traditionelle virustiteren output, men give mere detaljerede mekanistisk information samt høj throughput kapaciteter 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet den praktiske anvendelse af en etapevis vaccinia reporter virus (TrpV), som giver reproducerbare, real-time feedback foranstaltninger af virus replikation. Ved hjælp af veldefinerede poxvirus-hæmmere, var vi i stand til at vise, at TrpV reagerer på en måde i overensstemmelse med den forstod virkningsmekanisme for hver inhibitor. Mens TrpV virus giver den mest omfattende information om virus stadie progression, to-trins (IREV, LREV) og single-etape (EV, IV, LV) virus kan også bruges på samme m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker SIGA Technologies (Corvallis, OR) for at give ST-246. DKR blev støttet af en NIH uddannelse tilskud i immunologi til Boston University (5T32AI 7309). Dette arbejde blev støttet delvist af P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, og RO3 (til JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas–monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
