Vaccinia Reporter Virus för kvantifiering Viral funktion i alla skeden av genuttryck
Summary
Vi beskriver användningen av en fluorescerande reporter vacciniavirus som möjliggör realtidsmätning av viral smittsamhet och genuttryck genom scenen specifika uttryck för spektralt distinkta reporter fluoroforer. Vi detalj en plåt-baserad metod för exakt identifiering av det stadium då virusreplika påverkas som svar på små molekyler hämning.
Abstract
Poxvirus är en familj av dubbelsträngade DNA-virus som inkluderar aktiva humana patogener såsom monkeypox, molluscum contagiousum och Contagalo virus. I familjen ingår även den smittkoppsvirus, Variola. På grund av komplexiteten av poxvirus replikering, många frågor fortfarande om deras genuttryck strategi. I den här artikeln beskriver vi begreppsbildning och användning av rekombinanta vacciniavirus som möjliggör realtidsmätning av en eller flera stadier av viral genuttryck i en hög genomströmning format. Detta möjliggörs genom användning av spektralt distinkta fluorescerande proteiner som reportrar för var och en av tre stadier av viral replikation. Dessa virus tillhandahåller en hög signal-till-brusförhållande under bibehållande av scen specifika uttrycksmönster, vilket gör att plattbaserade analyser och mikroskopiska observationer av virus förökning och replikation. Dessa verktyg har användningsområden för antiviral upptäckt, studier av virus-värd interaktioner, och evolutionär bionik.
Introduction
Traditionellt studeras virus uttryck med hjälp av molekylärbiologisk teknik (t.ex. Northern blotting, western blotting, microarray hybridisering, etc.) 1. Även om dessa metoder kan ge detaljerad information avseende kategori uttrycket ändras enskilda mRNA eller proteiner, de är oftast inte mottagliga för realtid och hög kapacitet processer. Alternativa tillvägagångssätt med fluorescensbaserade reportrar har tillämpats tidigare när man arbetar med poxvirus; dock har deras utveckling och användning motiverats av olika syften. Flera sådana metoder utformades för val av rekombinanta virus 2,3. Dessa tekniker uttrycker EGFP vid korrekt införlivande och uttryck av exogena DNA från rekombinanta vaccinia kloner. Likaså flera vacciniastammar stabilt uttrycker lösliga EGFP eller GFP-märkta proteiner som uttrycks i en infödd vaccinia promotor har använts i stor utsträckning. Dessa är typmatiskt för att kvantifiera virus inresa och replikering under antikroppsbaserade neutraliseringsanalyser, kemisk hämning, eller jämförelse av antiviral effektivitet 4-6. Även om dessa virus har visat sig användbara, de är begränsade i sin förmåga att ge detaljerad information om platsen för inhibition på grund av deras användning av en enda tvetydiga tidig / sen viral promotor. Tidigare metoder har också använt sig av EGFP protein med suboptimala signal-till-brus-karakteristika.
På grund av komplexiteten av poxvirus replikering och avsaknaden av befintliga verktyg för att analysera realtid förändringar i viral genuttryck, har vi utvecklat en svit av enkel-och flerstegs reporter virus 7,8. Som beskrivits i tidigare publikationer, dessa virus uttrycker en, två, eller tre spektralt distinkta fluorescerande proteiner från infödda vaccinia tagare under tidig, mellanliggande, eller sena stadier i infektion. Dessa virus kan vara ossed som indikatorer på virusreplika framsteg med hjälp av en fluorescensmikroskop och de är lika väl lämpade för hög genomströmning plåt-och-läsarbaserade analyser. Dessa virus är enkla att använda i stället för vildtypsvirus, växer med liknande kinetik för att nå motsvarande titer 7. Under planeringen och skapandet av dessa virus, var mycket omsorg på att välja fluoroforer som har höga signal-till-bakgrundsegenskaper med överlägsen fällbara effektivitet för att underlätta tillförlitlig kvantifiering med snabb återkoppling på förändringar i uttryck (Venus, mCherry och TagBFP). Dessutom var kombinationer av virala promotorer väljs som producerar high fidelity, entydig skede specifika uttryck, som ger information om hela utbudet av tidigt (C11R promotor), intermediär (G8R promotor) och sena (F17R promotor) genuttryck, till skillnad från tvetydiga tidiga / sena promotorer.
Dessa virus kan användas som ett verktyg för att investigating livscykeln för den prototypiska poxviruset, vacciniavirus. Mycket är fortfarande inte känt om samspelet värd-virus trots sin långa historia av studien. Vaccinia är komplex, som producerar över 200 unika proteiner, av vilka många är immunmodulerande och värd antagonistiska. Vid infektion, vacciniavirus börjar omedelbart tidig mRNA-transkription. Detta underlättas av en RNA-polymeras och transkriptionsfaktorer som lästs in på det virala genomet under virion förpackningar och hålls i ett paustillstånd tills efterföljande infektion. Denna tidiga uttryck producerar proteiner som krävs för undertryckande av värdens immunsystem (mRNA decapping, dsRNA kvarstad, och lockreceptorproteiner samt hämmare av apoptos, stress, och Toll, IL, och NF-kB-signalering) och genom replikering. Tidig uttryck producerar också transkriptionsfaktorer som är nödvändiga för mellanliggande uttryck. Mellan uttryck med uttrycket av sena skede transkriptionsfaktorer. Dettauttrycks kaskad leder till produktion av strukturella och enzymatiska virusproteiner under sena stadier av infektion, som är nödvändiga för kompletta enheter av den mogna vaccinia virus.
Vår uppsättning av fluorescerande reporter virus möjliggör snabba framsteg i förståelsen av poxvirus biologi. En av de vanligaste och mest tidskrävande metoder inom virologi är tillväxtanalys. Detta involverar typiskt att infektera celler, anta en rad behandlingar, skörd viruset genom att lysera infekterade celler, och att kvantifiera den resulte virustiter genom plackanalys. Använda reporter virus som beskrivs här möjliggör realtidsmätning av virustillväxt som lätt kan analyseras och jämföras mellan många behandlingar som utförs parallellt. Vi förutser denna uppsättning av reagens kommer att användas i olika protokoll för att identifiera förändringar i viralt genuttryck som svar på läkemedelsbehandling, RNAi knockdown, eller begränsning värdområde.
Denna metod gör det också hög innehållsanalys i större skala än tidigare, vilket möjliggör hög kapacitet antivirala läkemedel skärmar för särskilt definierade mål stadier av intresse. Medan många potentiella behandlingar för att bekämpa poxvirus infektion har identifierats godkände enda FDA terapier effektiva för behandling av poxvirus infektion är den acykliska fosfonat nukleosid, Cidofovir, och behandling med vacciniavirus immunglobulin 9,10. Trots att utrota smittkoppor 1977 11, poxvirus står ett betydande hot mot människors hälsa 12. Upphörande av utbredd vaccination mot Variola virus har lett till ökad mottaglighet för andra poxvirus 13. Till exempel är områden i Centralafrika tidigare skyddade genom vaccination upplever ett uppsving i Monkeypox virusinfektioner 14. Betydande problem har också varithöjde avseende latent känslighet för avsiktliga utsläpp av Variola virus. På grund av begränsade behandlingar nu tillgängliga, finns det ett akut behov av utveckling av nya behandlingar. Dessa reporter virus tillåter snabb och high-throughput screening småmolekylära hämmare för hämning av ett visst skede av virusreplikation. Identifiering av inhibitorer som riktar virala uttryckssteg för närvarande inte föremål för inhibition kommer att underlätta utvecklingen av kombinationsbehandlingar med ökad styrka.
Mycket kan utläsa om vaccinia cellbiologi genom att observera förändringar i varje steg är genuttryck. Dämpning genom kemisk eller genetisk manipulering av en infekterad värdcell uttrycks typiskt i form av minskade virala titrar. Men genom att jämföra förändringar i varje skede av virusuttrycks kaskad, kan man få en mer fullständig förståelse av hur virus kondition är påverkaned av en viss behandling. Dessa uppgifter har visat sig korrelera väl med den traditionella virus titer utgång, men ger mer detaljerad mekanistisk information samt hög kapacitet kapacitet 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit den praktiska användningen av en flerstegs vacciniavirus reporter virus (TrpV), vilket ger reproducerbara, realtidsrespons åtgärder för virusreplikation. Genom att använda väldefinierade poxvirus hämmare, kunde vi visa att TrpV reagerar på ett sätt som överensstämmer med den förstod verkningsmekanism för varje inhibitor. Medan TrpV viruset ger den mest omfattande information om virus skede progression, två steg (IREV, LREV) och enda steg (EV, IV, LV)-virus kan också användas på sam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar SIGA Technologies (Corvallis, OR) för att ge ST-246. DKR stöddes av en NIH utbildningsbidrag inom immunologi till Boston University (5T32AI 7309). Detta arbete stöddes delvis av P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, och RO3 (till JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas–monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
