Sonikering-underlättas immunofluorescensfärgning av Late steg embryonala och Larv<em> Drosophila</em> Vävnader<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Studier utförda i Drosophila melanogaster embryon och larver ger viktig inblick i utvecklingsprocesser såsom cell öde specifikation och organogenesen. Immunfärgning möjliggör visualisering av att utveckla vävnader och organ. Men en skyddande nagelband som bildas i slutet av embryogenes förhindrar genomträngning av antikroppar i embryon sen fas och larver. Medan dissektion före immunfärgning används regelbundet för att analysera Drosophila larver vävnader, visar sig ineffektivt för vissa analyser eftersom små vävnaderna kan vara svår att hitta och isolera. Sonikering ger ett alternativ till dissektion i larv Drosophila immunfärgning protokoll. Det möjliggör en snabb, samtidig bearbetning av ett stort antal embryon sen fas och larver och håller in situ morfologi. Efter fixering i formaldehyd, är ett prov sonikeras. Prov utsattes därefter för immunfärgning med antigen-specifik primär myraibodies och fluorescerande sekundära antikroppar att visualisera typer målcellen och specifika proteiner via fluorescensmikroskopi. Under processen att ultraljudsbehandling, är korrekt placering av en ultraljudsond över provet, samt varaktighet och intensitet ultraljudsbehandling, kritisk. Tilläggsupplysningar smärre modifieringar av standardimmunfärgning protokoll kan krävas för högkvalitativa fläckar. För antikroppar med låg signal-brusförhållande och längre inkubationstider är vanligtvis nödvändigt. Som ett bevis på konceptet för denna ultraljudsbehandling-underlättas protokoll visar vi immunostains av tre vävnadstyper (testiklar, äggstockar och neurala vävnader) vid en rad utvecklingsstadier.

Introduction

Drosophila embryon och larver utgör en utmärkt modell för att studera utvecklingsprocesser i många organ och vävnader. Avbildning av enskilda celler är ofta nödvändigt i dessa studier för att fastställa de komplexa miljöer där celler utvecklas. Visualisering av celler i vävnader kan åstadkommas genom immunfärgning. Väl beskrivna immunfärgning protokoll finns för embryonala Drosophila vävnader <17 h efter äggläggning (AEL) ^1-3. Men en skyddande nagelband former mot slutet av embryogenes, för effektiv antikroppsträngning. Således är dessa immunfärgning protokoll är ineffektiva i analysen av vävnader i embryon sen fas och i senare stadier av larvutveckling (1 ^st stadiet (L1), ^{2: a} stadiet (L2), och ^{3: e} stadiet (L3)). Denna ineffektivitet innebär ett hinder för vår förståelse av dynamiska processer som sker under denna förlängda utvecklingsperiod ^4. Tissue dissektion är en allmänt anställd teknik för att kringgå detta hinder ^5-7. Däremot kan dissektion visa sig ineffektiv. Extraktion kan belastas av svårigheter att lokalisera eller isolera embryonala och larv vävnader. Vidare kan avlägsnas fysiskt målvävnader skada genom att brista dem eller genom att inte packa upp dem i sin helhet.

Sonikering är ett förfarande som använder ljudvågor för att störa intermolekylära interaktioner. Det har använts för att störa integriteten hos Drosophila larver ytterhud för att immunostain utvecklar neurala celltyper ^6. Detta protokoll har anpassats för att immunostain sent skede embryonala och larvkönskörtlar, som kan vara så små som 50 pm i diameter ^8-10. Genom sådana studier har processen av manliga könsceller stamceller (GSC) nischbildning karaktäriserats i sen Drosophila embryon ^8-10 och mekanismer som reglerar stamcellsutveckling och difpassad undervisning i sen utvecklingsfas embryonala könskörtlar och larver har klarlagts ^9-12. Således ger ultraljudsbehandling ett effektivt alternativ till vävnads dissektion som kan vara svårt på grund av vävnadsstorleken. Vidare möjliggör den immunofärgning av Drosophila vävnader in situ, vilket lämnar celler inom ramen för hela organismen och bibehålla in situ morfologi. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för fluorescens immunfärgning av sent stadium embryonala genom tidig / mitten L3 vävnader in situ. Analys av Drosophila gonadal och nervvävnad visas i Representativa resultat för att visa effekten av detta protokoll. Vidare kan denna immunfärgning protokoll anpassas för att analysera andra Drosophila vävnader samt vävnader i andra organismer med en yttre ytterhud.

Protocol

1 Beredning av en samling Cage Bedöva unga, fertila flugor med CO2. Överför sövda flugor till en bur. För att få optimalt utbyte, använd 100-120 vuxna flugor som sträcker sig från 2-7 dagar gamla vid en 4: 1 förhållandet mellan honor till hanar. Tillåt flugor en lämplig acklimatiseringsperiod, ~ 24 timmar innan man erhållit prov för fixering. Om buren inrättades med jungfru honor paras med hanar, en användning a 36-48 timmar acklimatiseringsperiod. På den öppna änden a…

Representative Results

För att visa effekten av ultraljudsbehandling baserade immunfärgning i analys av sent stadium embryon och larver vävnader in situ, var vildtyp embryon och larver behandlas för immunfärgning av testiklar, äggstockar, och nervvävnad. Prover avbildade via konfokalmikroskopi och representativa resultat visas (Figur 1 och Figur 2). Resultaten visar att den beskrivna protokollet är effektivt för att visualisera morfologiska egenskaper samt enskilda celler i situ und…

Discussion

Detta protokoll ger en metod för att framgångsrikt immunostain rikta Drosophila embryonala och larv vävnader på plats, vilket eliminerar behovet av dissektion. Per tidigare protokoll för färgning tidiga embryon ^1,2,3 är chorionic membranet avlägsnas med hjälp av 50% blekmedel (NaOCl). Proverna fixerades i formaldehyd och metanol. Eftersom larv ytterhud orsakar äldre prov att flyta, är hela provet sedan passera genom ett cellfilter för att säkerställa larv retention. Prov lagras…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter