In vitro Aggregation assays under anvendelse af hyperphosphoryleret tau-protein

Summary

Umodificerede og hyperphosphorylerede tau-proteiner blev anvendt i to in vitro aggregation assays til at afsløre hyperphosphoryleringsbegivenheder-afhængige hurtig sammenlægning kinetik. Disse assays bane vejen for fremtidige skærme for forbindelser, der kan modulere tilbøjelighed hyperphosphoryleret tau at danne fibriller, der ligger til grund for progressionen af ​​Alzheimers sygdom.

Abstract

Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

Alzheimers sygdom (AD) er en af ​​en stor samling af neurodegenerative lidelser kendt som tauopatier. Indbegrebet patologi underliggende tauopati er de neurofibrillære sammenfiltringer, NFT'er, i neuroner, astrocytter og mikroglia ^1-4. NFT tæthed korrelerer med kognitiv svækkelse ^3,5 og neurontab ^6. NFT primært indeholder hyperphosphoryleret tau protein (benævnt "p-tau" nu), der danner lige eller parrede spiralfilamenter (PHF) ^7,8. Tau er et mikrotubulus-associeret protein menes at lette axonal transport, som er afgørende for neuronal signalering og handel ^9,10. Hver tau-molekylet indeholder 2 til 3 fosfater i normal hjerne, men phosphoryl indhold stiger med flere folder i tauopati patienter ^11. Flere kinaser vil sandsynligvis bidrage til tau hyperphosphorylering herunder GSK3p (glycogensyntasekinase 3β) og CDK5 (cyclin-degige kinase 5) ^12,13, men den direkte udløsende faktor for patologisk phosphorylering stadig vanskeligt at definere ^14. Unormal phosphorylering i eller i nærheden af mikrotubulus-bindende motiver dissocierer tau fra mikrotubulus ^15, og forårsager tau mis-lokalisering til somatodendritisk rum, hvor p-tau oligomeriserer i lige eller parrede spiralformede filamenter, som eventuelt kan polymerisere i NFT inklusioner. Den tætte forbindelse mellem tau-hyperphosphorylering, NFT formation og neurodegeneration førte til en fremherskende hypotese, at p-tau tangles fremkalde apoptotiske og andre cytotoksiske responser, og dermed er den underliggende årsag til tauopati neurodegeneration ^16,17. Drug skærme og tidlige kliniske tests baseret på denne forudsætning er der lanceret ^18. Denne hypotese står imidlertid udfordringer ^19,20. For eksempel SantaCruz et al., Viste, at de kognitive funktioner af transgene mus kan forbedres ved at undertrykke ekspressionen af et mutanthumant tau, selvom NFT'er fortsat at danne fra eksisterende taumolekyler ^21. I en Drosophila model blev NFT vist at sekvestrere toksiske cytosoliske tau at beskytte de underliggende neuronceller ^22,23. Det er klart, patogenesen rolle NFT, hvis nogen, i høj grad vil påvirke retningen af ​​tauopati terapeutiske udvikling.

I høje koncentrationer, rekombinante eller normal hjerne tau-protein spontant men langsomt polymeriserer i en PHF-lignende struktur in vitro som angivet ved binding af adskillige β-sheet foretrukne fluorescerende farvestoffer, elektronmikroskopi, og lysspredning spektroskopi ^24-27. Tilføjelse heparin eller arachidonsyre, en rigelig fedtsyre i human hjerne, drastisk accelererer PHF-dannelse i tau isoform- og inducer koncentrationsafhængige måder ^28-32. Interessant nok hyperphosphoryleret tau oprenset fra AD-hjerner eller fremstillet ved udtømmende in vitro phosphoryleringsreaktioner enggregates hurtigere og mere effektivt ^26,33-35. Disse resultater er i fremragende aftale med de patologiske roller p-tau. Et in vitro system baseret på sammenlægning af p-tau kan således fungere som et effektivt redskab til AD drug screening.

I betragtning af den tætte sammenhæng mellem tau sammenlægning og den gradvise neurodegeneration af AD, samt det nylige sammenbrud i lægemiddeludvikling rettet Ap plak, en anden vigtig histologisk markør for AD ^36-38, interessen i at opdage lægemidler, der kontrollerer tau sammenlægning er stigende. Faktisk har adskillige grupper allerede begyndt narkotika skærme ved forskellige gennemløb under anvendelse af in vitro tau aggregation reaktioner som den primære assay. Der blev fundet en række kemikalier til at udstille hæmmende eller vending aktiviteter på tau sammenlægning in vitro ^39-42. Men alle aktuelle tau sammenlægning regulator skærme bruger umodificeret tau, der misser nøglen patologiske mærke fosforylation, hæve en bekymring for specificiteten og effekten af ​​anvendelse af disse forbindelser i AD behandling.

En af de store forhindringer for at udvikle sammenlægning analyser til biokemisk karakterisering og AD lægemiddelscreening er produktionen af ​​tilstrækkelige mængder af det patofysiologisk relevant hyperphosphoryleret tau protein. Brug af lynlåse assisteret katalyse, i hvilket 1N4R isoform af tau og GSK-3β kinase er co-udtrykkes i E. coli som leucin-zipper fusionsproteiner har vi overvinde denne udfordring (. Sui et al fremlagde, se figur 1 for de endelige produkter af tau og p-tau, se også ⁴³ for foreløbig massespektrometri karakterisering af p-tau). Fra et panel af ni antistoffer specifikke for forskellige phosphoryleringssteder af tau, blev positive signaler ses i otte positioner (data ikke vist). Nedenfor beskriver vi protokoller og besætninger, der kan differentiere sammenlægning kinetiske differences mellem umodificeret tau og p-tau arter. Disse analyser blev ændret fra offentliggjorte protokoller, målte stigningen i fluorescens af Thioflavin T (ThT) eller Thioflavin S (THS) efter amyloid (tau aggregater) bindende ^26. I den første "terminal", ikke-dye fremgangsmåde er sammenlægning reaktioner samlet og inkuberet i fravær af amyloid farvestof. På forskellige tidspunkter, er en portion af hver reaktion fjernet og blandet med lige så stort volumen af ​​ThT-holdige buffer at stoppe aggregering og tillade ThT at binde tau aggregater. Fluorescens måles af en IAP FluoroMax-2 fluorometer. I den anden "med-dye" løbende overvågning assay, ThT eller THS er i aggregeringen reaktioner. Fluorescens kan måles løbende under hele forsøget manuelt eller ved hjælp af en multi-pladelæser. Desuden beskriver vi et assay, der anvender en næsten fysiologisk koncentration af tau og p-tau for aggregering i den løbende måling mode. Virkningen af ​​phosphorylering forbliver let påviselig. Nedenfor vil vi beskrive trin-for-trin drift procedurer, og viser repræsentative resultater af disse analyser. Diskussion af nogle af de fordele og ulemper ved hver metode, samt potentielle lægemiddel screening applikationer vil følge.

Ved en høj koncentration, tau aggregater i amyloid-lignende strukturer spontant. Men i laboratoriet, tau fibrillization typisk accelereres ved sådanne inducere heparin (gennemsnitlig molekylvægt 6.000 g / mol) og arachidonsyre. Eksempler er vist heri, indbefatter 30 pM heparin. Dannelsen af ​​tau amyloid aggregater overvåges af fluorescens som følge af amyloid binding ved thioflavin T (ThT) eller thioflavin S (THS). Ved binding til Tau aggregater ThT udviser en rød forskydning i fluorescens (excitation: 450 nm; topemission: 485 nm). THS på den anden side har svagt emission ved 510 nm (excitation ved 450 nm) før amyloid binding, men dette fluorescence øges betydeligt i nærværelse af en amyloidprotein såsom den aggregerede tau ^44. Begge farvestoffer fungerer godt i forbindelse med afsløring tau og p-tau sammenlægning. På grund af den stærke og relativt bred emission peak af ThT (se figur 2), er der kun 30% reduktion i fluorescens enhed ved 510 nm. For nemheds skyld bruger vi den samme kombination af excitation / emission bølgelængder (dvs. 450 nm / 510 nm) til at overvåge tau aggregering ved brug af enten farvestof.

Tau aggregation kan ske i nærvær eller fravær af farvestoffet, afhængigt af formålet med analysen og tilgængeligheden af ​​tau-protein. Begge former for reaktioner er vist nedenfor. Derudover viser vi driften af ​​to forskellige instrumenter – en enkelt prøve fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) og en multi-plade-læser (SpectraMax M2). Læserne skal kunne tilpasse disse protokoller, der passer til deres specifikke behov og instrument tilgængelighed.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser Forbered aggregering buffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Opbevares ved stuetemperatur, stabilt i flere måneder. Supplement 1 mM dithiothreitol (DTT) før brug. BEMÆRK: en HEPES-buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) producerer også lignende resultater i tau sammenlægning. Forbered thioflavin T eller thioflavin S stamopløsning (3 mM, opløst i aggregering buffer), og filter med 0,22 um sterilt filterenhed. Opbevares ved -20 ° C i…

Representative Results

Brug af rekombinant tau og p-tau (figur 1), etablerede vi to forskellige protokoller til sammenligning kinetikken for sammenlægning af tau og p-tau, at drage fordel af den stærke fluorescensemission af ThT og THS efter binding til amyloidal proteinaggregater, herunder tau og p-tau (figur 2). Med eller uden det fluorescerende farvestof i aggregeringen reaktion observerede vi konsekvent forøgelse af tau aggregation af hyperphosphorylering (figur 3-5). Denne stimulering…

Discussion

Denne protokol demonstrerer forskellige assaybetingelser og instrumenter, der registrerer de phosphoryleringsafhængige hurtigt tau sammenlægning kinetik. I terminalen assay fluorescens farvestof ThT tilsættes til en portion af fjernet fra master mix på hvert tidspunkt reaktion. Amyloid binding-induceret fluorescens måles derefter ^26. I den anden, med farvestof tilstand, tau aggregation udføres i nærvær af ThT eller THS, hvilket gør denne type reaktion er egnet til tidstro automatisk vurdering af væk…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4°C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80°