Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Spermier är ganska unik bland celltyper. Även produceras i testiklarna, båda kärnvapen gen transkription och translation avstängd när den förelöpare runda cellen börjar långsträckt och differentiera till vad som morfologiskt erkänd som en spermie. Dock är sädescell väldigt omogen, inte har någon förmåga till motilitet eller ägget erkännande. Båda dessa händelser inträffar när spermier transitering en sekundär orgel kallas bitestikeln. Under ~ 12 dagars passage som det tar för en spermie att passera genom bitestiklarna, post-translationella modifieringar av existerande proteiner spelar en central roll i mognaden av cellen. En viktig aspekt av en sådan är proteinfosforylering. För att karakterisera fosforylering evenemang som äger rum under spermiemognad, måste såväl rena spermier cellpopulationer och pre-fraktionering av fosfopeptider upprättas. Använda tillbaka spolningsteknik, en metod för isolering av ren spermatozo of hög kvalitet och avkastning från de distala eller caudal bitestiklar beskrivs. Stegen för solubilisering, matsmältning, och pre-fraktionering av spermier fosfopeptider genom TiO 2 affinitetskromatografi förklaras. När isolerat, kan fosfopeptider injiceras i medlemsstaterna att identifiera både proteinfosforylering händelser specifika aminosyror och kvantifiera nivåerna av fosforylering sker under spermier mognadsprocesserna.
Efter att ha vuxit fram ur testiklarna, är spermier högt differentierade ännu anmärkningsvärt, dessa celler är omogna 1,2. Som sådan, de saknar fullständig funktionalitet, inklusive möjligheten att simma och binder till en äggcell 3. Även det krävs ytterligare mognaden av spermie, detta inte kan ske via kanoniska vägar, eftersom i detta skede av sin celldifferentiering process, de är oförmögna att gentranskription och ytterligare protein biosyntesen 4. Biologisk behörigheten tilldelas spermier när de lämnar testikeln och ange en del av det manliga reproduktiva systemet kallas bitestiklarna 5. Bitestikeln är en tätt lindad, mycket differentierade röret som förbinder de efferenta kanalerna (i testiklarna) till sädesledaren och finns i alla manliga däggdjur 6. Spermier successivt förvärva deras gödsling potential under epididymal härkomst, att förlita sig på den ständigt föränderliga luminala miljö som är speated av de lokala epididymala epitelceller 7. De olika sekretoriska och åter absorberande aktiviteter som finns i epididymal milieu agera för att ändra spermier själv, ändra dess protein, kolhydrater och fett sammansättning 6. Vikten i bitestiklarna, speciellt den inledande "caput" region i denna struktur har exemplifierats med kirurgiska ligeringstekniker 8. Spermier kvar i testiklarna genom efferent kanal ligering saknas helt i någon egenskap att befrukta äggcellen 9-11.
Förutom epididymal miljön, till signaltransduktionsvägar inom spermiema arbete post-translationellt modifiera existerande spermie komplement. Till exempel, spermier från tidigt regioner bitestiklarna visa olika mönster av proteinfosforylering jämfört med de sistnämnda områdena 5,12. Detta är inte förvånande eftersom det finns stora skillnader i capability av spermier från dessa regioner. Till exempel, spermier från tidigt, caput bitestiklarna är immotilite. Däremot kommer spermier från cauda regionen genomgå framåt progressiv motilitet gång placerats i isoton medium. Eftersom epididymal spermierna är oförmögna att de-novo proteinbiosyntes måste alla de inneboende signalvägar som reglerar spermiefunktion ske genom post-translationella modifieringar (PTM). Därför är det förståeligt att proteomik, särskilt utredningen av PTMs såsom fosforylering måste vara en viktig drivkraft för att vi ska förstå spermie mognad.
En alternativ metod för att få spermier från epididymidies att använda retroåterspolnings 13-16. Även om denna teknik är definitivt mer tidskrävande och tar en större grad av skicklighet av operatören, spermier erhålls konsekvent visa renhet på över 99,99%. Dessutom, till skillnad från alla andra tekniker, spermatozo CAn isoleras i ett vilotillstånd, vilket gör det möjligt att studera hur spermierörlighet initieras. Som provberedning är den viktigaste aspekten för proteomik analys, har isolering av spermier blivit en av de viktigaste aspekterna av spermier-proteomik studier. Protokollet ger en förklaring på hur spermier är isolerade från cauda epididymis. Efter detta är TiO 2 fosfopeptiden förfarande anrikning skiss, med särskild hänvisning om hur man extraherar peptider från de mycket differentierade spermier. Kan användas MS metod för att särskilja föränderliga fosfopeptider om man skulle jämföra den kaudala epididymala spermier i ett tillstånd (immotile eller icke-capacitated) till en annan (motila, capacitated, akrosom reagerade, etc.) vilket gör detta en kraftfull metod för att studera sperma funktion.
De kritiska stegen för en lyckad och reproducerbar proteomic analys av spermier är: 1) renhet hos utgångsmaterialet; 2) avlägsnande av oönskade salter och rengöringsmedel; 3) denaturera proteiner i full utsträckning så att trypsin för att smälta ett högt utbyte av proteiner och 4) minimera provhantering för att minska förlust av peptid.
För att framgångsrikt backspola cauda epididymis, är det viktigt att hitta det område från vilket spermier avslutas. I fallet med både råtta och möss, detta är vid spetsen av den konkava ytan, i mitten av den kaudala området av epididymis (se Figur 2A). Om man kommer vidare mot sädesledaren är backspolning lättare och framgången är generellt högre. Dock kommer denna vid förlust av siffror spermier. Alternativt, om man försöker att röra sig mer proximalt till corpus, då mängden tryck som krävs för att trycka spermiema tillbaka genom epididymal kanaler är ofta så höga, att skador på bitestikeln sker oundvikligen.
Backspolning i bitestiklarna traditionellt utförs med hjälp av vattenmättad mineralolja och en balanserad saltlösning i sprutan själv som ett medium för att ta bort spermier 22-25. Båda förfarandena är potentiellt problematiskt av LC-MS. För det första kommer sannolikt att blockera nano C18 nano kolumner som i grunden används över hela världen för proteomik analys och omsorg måste tas så att ingen överförs i förfarandet mineral. Om detta inträffar, är det omöjligt att fortsätta och provet huvudsak förlorat. Detta kan övervinnas genom användning av BWW eller andra balanserade saltlösningar i sprutan, men, även om detta är framgångsrikt, vi medgav snart att många av spermiema bli rörliga så snart BWW lösningen kom i kontakt och blandas med den kaudala epididymal celler. För att kringgå detta problem har vi backspola enkelt spermiema med luft. Inte bara är qualten av spermier som är jämförbar med vätskebaserade metoder, men mängden är identisk.
Phosphoproteomics är kanske en av de enda sätten att fastställa vilka signalvägar förekommer i spermier efter utlösning. En av de stora vägarna som vi undersöker är processen för capacitation. Spermier måste genomgå "kapacitering" innan det är i stånd att binda till ett ägg. I praktiken uppnås detta i huvudsak genom att inkubera spermatozo under en tidsperiod (mus 40 min; råtta 1,5 h; humant 3-24 h) i BWW-lösning med serumalbumin. Tidigare har vi och andra visat en roll i flera kinaser involverade i capacitation. Av intresse, radering av PKA μ II producerar möss vars spermier simma spontant in vitro, men kan inte genomgå aktivering 26. Det senare är ett kännetecken för kapacitering, vari spermatozoer ändra sitt simning mönstret från en hög hastighet, låg amplitud, till en låghastighet, hög amplitud slå frekvens. Vi har visat nedströms kinaser är involverade i denna process inkluderar pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 och c-ABL 14. Intressant hämning av SRC stoppar capacitation beroende tyrosinfosforyleringen 13. Detta kan dock lösas med okadainsyra, vilket tyder på att SRC inte är direkt involverad i den allmänna uppkomsten av tyrosinfosforylering 29 men kan reglera en fosfatas 29. Problemet med att använda BWW som ett medium för att tvinga spermier ur epididymis är att när de väl aktiverats, mus spermatozoer endast ta cirka 40 min till capacitate. Med tanke på att isolering av spermier kan ta 5 min / mus och ofta flera möss används i ett experiment, då spermier blir i olika stadier av förfall i början av experimentet. För att övervinna detta, kan lufttryck användas för att trycka sädescellerna från svans epididymis i ett glas kanyl. Inte bara är alla spermierna inaktIve och i huvudsak som de skulle finnas i kaudala miljön, det gör det möjligt att jämföra icke-rörliga och rörliga phosphoproteomics.
Prov hantering för phosphoproteomics bör hållas till ett minimum när man jämför spermier i två olika funktionella stater. Användningen av metanol kloroform över andra traditionella metoder för protein nederbörd 1) minskar behovet av extra tvättsteg, 2) tar bort nästan alla spår av salter och fetter samt 3) har en bevisad förmåga att fälla låga överflöd proteiner över TCA 19. Protein nederbörd före trypsindigerering rekommenderas eftersom inte bara gör denna hjälp att denaturera protein (som stöd trypsindigerering), men tar bort många av de MS-inkompatibla metaboliter som finns i cellen.
Jämförelsen av sperma fosfopeptider kan göras på ett antal sätt. På grundläggande nivå, en enkel jämförelse mellan den identifierade fosfopeptiden i ett prov, för ett i en annanprov i processen som kallas "spektral räkning" kan göras. Kritiken har dock varit på detta tillvägagångssätt i grunden eftersom tidiga proteomikstudier använde låga replikat (För en utförligare diskussion se et al. Lundren 30). En mer sofistikerad metod är att titta på intensiteten av peptiden modermassan och jämför detta med de andra proverna (märkningsfri jämförelse). I exemplet som visas i figur 4 kan t ex en peptid frånvarande från den från icke-motila (Figur 4 överst) men förekommer hos den rörliga (fig 4 botten) spermatozoer från m / z 650 till 670 ses. Denna process, kallad MS-baserade etikett fri kvantifiering är en etikett fritt strategi.
En alternativ strategi som vanligen används för att minska mängden av körningar som erfordras för proteomic kvantifiering är att använda isotoper. Eftersom massan av en isotop är annorlunda, kan masspektrometern användas för att jämföra intensiteterna för eluting peptider. Men till skillnad från de flesta andra celltyper, vissa isotopmärkning kan inte tillämpas på spermier. Till exempel, tillsats av stabila isotoper (en tung isotop läggs till ett prov, medan en lättare version läggs till en annan) kan användas i vävnadskultur. När isotoper får införlivas i proteinet, kan en proteomik analys utföras genom att kombinera de två prover (multiplexing). Men i fallet med spermier, kan detta inte ske, enbart på grund av det faktum att 1) isotopmärkning kräver flera passager (upp till 8) i vävnadskultur och 2) spermierna saknar nukleär gen transkription och translation och därmed, de kan inte infoga isotoper i all sin protein ändå. Ett sätt runt detta är att beställa radiomärkta möss, men dessa är notoriskt dyra. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda en kemisk tagg. Detta har gjorts när icke-capacitated möss jämfördes med capacitated möss. I det här fallet, en D 0 och en D <sub> 3 -märkt användes för att skilja mellan ett prov och en annan i masspektrometer 31. Andra metoder kan omfatta användning av iTRAQ (isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering), vari lysiner märks kemiskt med olika mass isotoper; ICAT (isotop kodad affinitetsmarkör) vari cysteiner är märkta med olika mass isotoper och tung och lätt vattenmärkning.
I varje enskilt fall måste dock en sak att komma ihåg. MS rapporterar bara vad som är närvarande i ett prov, och detta är en återspegling av allt som har hänt med det provet fram till den punkten. Minimera provhantering samtidigt maximera avkastningen på varje steg är nödvändigt för en lyckad proteomik analys.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |