Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

Summary

Det isolerte blod-perfusjon lunge preparatet gjør det mulig å visualisere microvessel nettverk på lungeoverflaten. Her beskriver vi en tilnærming til å kvantifisere permeabilitet av enkelt microvessels i isolerte lungene ved hjelp av sanntids fluorescens bildebehandling.

Abstract

Den isolerte blod-perfundert lunge preparatet er mye brukt til å visualisere og definere signalering i enkelt microvessels. Ved å koble dette preparatet med sanntid bildebehandling, blir det mulig å bestemme permeabilitet endringer i individuelle lunge microvessels. Heri vi beskrive tiltak for å isolere rotte lungene og perfuse dem med autolog blod. Så, vi skissere tiltak for å sette mot fluoroforene eller agenter via en microcatheter inn en liten lunge regionen. Ved hjelp av disse prosedyrene som er beskrevet, vi bestemt permeabilitet økning i rotte lunge microvessels i respons til infusjoner av bakteriell lipopolysakkarid. Dataene viste at lipopolysakkarid økt væskelekkasje på tvers av både venular og kapillær microvessel segmenter. Således gjør denne metoden det mulig å sammenligne permeabilitet responser blant vaskulære segmenter, og dermed definere en hvilken som helst heterogenitet i respons. Mens vanlige metoder for å definere lunge permeabilitet krever etterbehandling av lunge vevsprøver, denbruk av sanntids avbildning unngår dette krav som framgår av den foreliggende fremgangsmåte. Således, den isolerte lunge preparatet kombinert med sanntids avbildning gir flere fordeler i forhold til tradisjonelle metoder for å fastslå lungemikrovaskulær permeabilitet, men likevel er en grei metode for å utvikle og implementere.

Introduction

Økt mikrovaskulær permeabilitet i lungene fører til utvikling av alveolær ødem og kompromittert gassutveksling og er en viktig egenskap av akutt lungeskade (ALI) ^1-3. Dermed estimater av vaskulær permeabilitet er viktige i å definere omfanget av lungeskade og effekt av foreslåtte terapeutiske intervensjoner. Gravimetrisk analyse slik som blod fri lunge våt-til-tørr-forhold og mikrovaskulær filtrering koeffisient er mye brukt metode for å estimere permeabilitet ^4,5. Andre metoder omfatter kvantifisere oppbevaring av radioaktive eller fluorescerende prober i lungevevet ^6-8. Men de ovennevnte metodene krever postexperiment behandling av lunge vevsprøver mot belyse permeabilitet data. Dessuten, siden ett dyr kan bare brukes for en enkelt behandling protokollen, store dyrenumre kan være nødvendig for en fullstendig undersøkelse. Et felles trekk ved de ovenfor angitte fremgangsmåter er at de bestemmer den midlere vaskulær permeabilitet foralle blodårene i vevsprøve. Imidlertid er det vel etablert at pulmonære mikro-og makro-fartøy er fenotypisk forskjellig ^ni. Derfor kan permeabilitet svarene være heterogene blant de ulike fartøysegmenter samt ^9,10. Dermed kvantifisere gjennomsnittlig permeabilitet av alle lunge skip i en vevsprøve ikke nødvendigvis gjenspeile dette heterogenitet.

I den isolerte blod-perfundert lunge forberedelse, kan blodårer på lungeoverflaten bli visualisert ved en oppreist mikroskop ^4,11,12. Dette gjør karakteriserer reaksjoner i enkeltfartøy og dermed ta opp eventuelle heterogenitet i svarene ^13. I tillegg, ved å benytte fluorescens-avbildning av microvessels, fluorescens-baserte assays kan være innarbeidet. Videre kan en venstre atrie microcatheter brukes til å levere agenter og fluorescens sonder i blodkar ^11,14. Den microcatheter begrenser levering til et lite lunge-området, således exposerer bare blodårene i regionen til de infused agenter og fluorophores. Dette gjør at flere små regioner innen den samme lungen som skal brukes for separate eksperimenter, som fører til en samlet reduksjon i dyr som er nødvendig for en undersøkelse.

Sanntid avbildning muliggjør fangst av dynamiske endringer i vaskulær og ekstravaskulær fluorescens av enkelt microvessels av den isolerte lunge forberedelse. Således, for hver microvessel innenfor et bildefelt, endringer i fluorescens i løpet av infusjon av fluoroforer og Awasking kan registreres, og kvantifiseres frakoblet ^14.. Bruke verdier av maksimal og rest vaskulær fluorescens, kan en permeabilitet indeks for hver microvessel innen bildebehandling feltet bestemmes. For å bestemme endringer i gjennomstrømningen i respons til inflammatoriske eller skadelige stoffer, kan det ønskede middel administreres først, og deretter permeabiliteten indeksen bestemmes. I tillegg kan bildefeltet settes hvor som helst innenfor den tette region infusert medmicrocatheter, og muliggjør en høy grad av fleksibilitet ved valg av den ønskede vaskulære nettverk. Dermed blir isolert blod-perfundert lunge forberedelse i tandem med sanntid bildebehandling gir en attraktiv eksperimentell modell for å kvantifisere permeabilitet i enkelt lunge microvessels.

Protocol

Alle eksperimenter utført på dyr var som godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Tennessee Health Science Center. En. Tubing for perfusert Rat Lung Forberedelser Forbered et rørsystem med Tygon rør (18) for blod perfusjon, som vist i figur 1.. Koble trykktransdusere (P23XL) og plasser rørene på objektbordet. Sett vannbad temperaturen til 37 ° C. Koble lunge innløp og utløp midlertidig med Tygon slange. <…

Representative Results

Et isolert blod-perfusjon lunge preparat som er koblet til perfusjon rør og tilhørende utstyr er vist i figur 2.. For demonstrasjonsformål, har vi brukt et Sprague Dawley-rotte, selv om fremgangsmåtene som er beskrevet her kan brukes med alle rotter arter. Infusjoner gjennom en venstre atrie microcatheter nå bare et lite område av lungen. Den tilført regionen kan identifiseres ved infusjon-indusert misfarging (Figur 3). Lungene preparat som posisjonert for sanntids avbildning er …

Discussion

Den isolerte blod-perfundert lunge forberedelser kombinert med sanntid bildebehandling gir et enkelt verktøy for bestemmelse av permeabilitet endringer i enkelt lunge microvessels. Vi har anvendt denne metode for å definere permeabilitet endres i respons til infusjon av LPS. Våre data klart tyder på at LPS infusjon forårsaket en økning i mikrovaskulær permeabilitet. Videre dataene indikerer også at permeabilitet endringer indusert av LPS var lik i begge venules og kapillærer. Således er en viktig fordel med de…

Materials

Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole  and a handle  to secure o-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4