Denne artikkelen beskriver bronchoscopic teknikker i storfe lunge under eksperimentelle forhold, dvs. bronchoscopically guidet inokulasjon, bronchoalveolar kylling, bronkial børsting, og transbronchial lunge biopsi.
Det er en pågående jakten på alternative dyremodeller i forskning av lungemedisin. Avhengig av målet med forskningen, store dyr som modeller av lungesykdom ofte ligner situasjonen for den menneskelige lunge mye bedre enn mus gjør. Arbeide med store dyr har også muligheten til å prøve det samme dyret gjentatte ganger over en viss løpet av tiden, noe som gjør at langtidsstudier uten å ofre dyrene.
Målet var å etablere in vivo prøvemetoder for bruk i en bovin modell av en respiratorisk Chlamydia psittaci infeksjon. Sampling bør utføres ved forskjellige tidspunkter i hvert dyr i løpet av studien, og prøvene bør være egnet for å studere vertsrespons, så vel som organismen under eksperimentelle betingelser.
Bronkoskopi er et verdifullt diagnostisk verktøy i human-og veterinærmedisin. Det er et trygt og minimalt inngrep. Dette article beskriver intrabronkial inokulering av leggene i tillegg til prøvetakingsmetoder for den nedre luftveier. Videoendoskopisk, fører intrabronkial inokulering i svært ensartede kliniske og patologiske funn i alle inokulerte dyr, og er derfor godt egnet for anvendelse i modeller av smittsomme lungesykdom. Prøvetakingsmetodene som er beskrevet er bronchoalveolar kylling, bronkial børsting og transbronchial lunge biopsi. Alle disse er verdifulle diagnostiske verktøy i human medisin, og kan bli tilpasset for eksperimentelle formål til kalver i alderen 6-8 uker. Prøvene ble målt var egnet for både patogen deteksjon og karakterisering av graden av lungebetennelse i verten.
Verdiene av stort dyr Modeller i biomedisinsk forskning
I moderne tverrfaglig biomedisinsk forskning, dyremodeller er fortsatt uunnværlig for å belyse komplekse interaksjoner – knyttet til helse eller en sykdomsstatus – innenfor pattedyr organismer. Til tross for 17 nobelpriser blir gitt til forskere som har studert storfe, hester, sauer, eller fjærkre som modeller for biomedisinsk forskning 1, er i dag det store flertallet av dyreforsøk foretatt med gnagere, mens mindre enn 1% av studiene jobber med husdyr eller husdyr.
Små dyr har mange praktiske fordeler (dvs. lavpris, genetisk formbarhet, høy gjennomstrømning, tilgjengelighet av en rekke genetiske og immunologiske verktøy og kits), og genmodifiserte murine modeller er generelt akseptert å utføre mekanistiske studier oppdage spesielle molekylære stier. I biomedisinsk forskning av komplekse systemer, than biologisk relevans og kliniske nytten av muse modeller blir stadig mer og mer tvilsom. De kan være misvisende og bære risikoen for overforenkling av biologisk kompleksitet 2-9.
På grunn av inter-arter særegenheter, vil ingen enkelt dyrearter helt speile menneskets situasjon, og bruk av mer enn én modell synes å være gunstig i et tverrfaglig biomedisinsk forskning tilnærming. I sammenheng med translasjonell medisin, store dyr tilbyr muligheten til å tjene som sammenligningsmodeller som gir resultater med høy biologisk relevans for dual bruk for både mennesker og dyrs helse en. Bemerkelsesverdig er det humane genom mer lignet med det bovine genom enn av genomet av laboratorie gnagere. Det har også blitt bekreftet nylig at, sammenlignet med andre taksa, er genomet av mus mye mer omar 10-12.
Bruk av husdyr i en kompleks studie design, tilbyr unique mulighet for intra-individuelle, langsiktige studier av gjentatt samling av en rekke prøver i vivo fra en-og-det-samme Individuum uten å ofre dyr. Derfor kan funksjonelle, inflammatoriske og morfologiske endringer overvåkes på samme emne over en viss tidsperiode 13.
Den Bovine Lung som en egnet åndedretts Model
På grunn av det høye antallet signifikante forskjeller i lunge anatomi, luft fysiologi og lunge immunologi, trenger mus ikke reprodusere mange viktige patofysiologiske aspekter av menneskets lungesykdom. Dette må tas i betraktning når du bruker dem som dyremodeller av luftveissykdom 2,9,14-16. Selv om særegenheter i anatomi og struktur finnes for hver pattedyr lunge, funksjonelle egenskaper (dvs. lungevolum, luftmengder og luftveis mekanikk) er bedre sammenlignbar mellom voksne mennesker og kalver på grunn av tilsvarende kroppsvekt(50 til 100 kg).
De artsspesifikke egenskaper ved storfe lunge oppsummeres som følger: venstre lunge består av to lapper (Lobus cranialis, som er delt inn i to segmenter, og Lobus caudalis), mens høyre lunge består av fire lapper (Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis, og Lobus accessorius). I motsetning til lungen anatomien til de fleste andre pattedyr, bronkie av de riktige kraniale lobe grener direkte fra den høyre laterale siden av luftrøret. Med hensyn til subgross anatomi, presenterer bovin lunge en høy grad av lobulation og en høy prosentandel av interstitielle vev 17,18 fører til en forholdsvis lav spesifikk lungesamsvar og en høyere pulmonal vev motstand 19.. Derfor er den nødvendige pusteaktiviteten ganske høy sammenlignet med andre arter 20,21. Den høye graden av lobulation fører til sterk uavhengighet av segmentene. Dermed inflammatory prosesser er begrenset av bindevev septa, og syke og friske segmenter ligger ofte innenfor samme lapp. På grunn av manglende sikkerhet i luftveiene, er det storfe lunge spesielt egnet til å speile obstruktive lunge dysfunksjoner 13. Angå vaskulaturen i bovin lunge, de små lungearteriene viser meget fremtredende glatte muskellagene. Derfor kan kalven også tjene som et godt etablert dyremodell av pulmonal hypertensjon eller vaskulær remodeling 22-24.
Med hensyn til luftveisinfeksjoner, naturlig forekommende sykdommer finnes i husdyr som har mange likhetstrekk med tilsvarende sykdom hos menneske. Typiske eksempler er bovin tuberkulose 25, syncytialt virus (RSV) infeksjoner hos kalver 26-28, eller naturlig ervervet klamydia-infeksjoner 29. Dermed trenger store dyremodeller ligner forholdene i den naturlige verten. Derfor er de mest useful for å studere host-patogen interaksjoner og de komplekse patofysiologien av den tilsvarende sykdom i mennesker 30,31.
Som en biologisk relevant modell av luft Chlamydia psittaci-infeksjon, ble kalver valgt fordi bovines representere naturlige verter for dette patogenet 32-35. Informasjon oppnådd fra denne modellen, med hensyn på patogenesen av sykdommen eller mulige overføringsveier mellom mennesker og dyr, vil bidra til å utvide vår kunnskap med virkningen for begge kveg og mennesker. Modellen kan også bidra til å verifisere allment aksepterte og alternative terapeutiske muligheter for eliminering av lunge C. psittaci infeksjoner, som er, igjen, av interesse både i veterinær-og humanmedisin.
Teknikker som brukes på og prøver skaffes fra Bovine Luftveiene
Dette notatet beskriver og illustrerer teknikker og diagnostiske metoder kan påførese til bovin lunge og benyttet i vår modell for å evaluere både virkningene av patogenet på pattedyr lunge og effekten av terapeutiske inngrep.
Bronkoskopi er utført i humanmedisin siden 1960-tallet og regnes som en sikker prosedyre 36. I kalver, ble eksperimentelle bronkoskopi beskrevet i 1968 for første gang 37. Den intrabronkial anvendelse av patogener ble foreslått av Potgieter et al. Som en pålitelig metode for å produsere nedre luftveissykdom hos kalver 38 og er nå en utbredt metode i bovin forskning 34,39,40. Intrabronkial inokulering av en definert mengde av organismen i henhold videoendoskopisk kontrollen kan for selektiv plassering av mikroorganisme i lungen. Dette fører til konsekvent kliniske og patologiske funn i alle dyr 34 og tillater målrettet prøvetaking av lunge regioner som forventes å bli endret på grunn av patogen eksponering.
<pclass = "jove_content"> Bronchoalveolar lavage fluid (Balf) er en godt beskrevet indikator for tilstedeværelsen og alvorligheten av lungebetennelse. Den bronchoalveolar lavage (BAL) er en standard prosedyre i humanmedisin for diagnose av en rekke sykdommer i luftveiene 41. I levende storfe, ble BAL introdusert av Wilkie og Markham i slutten av syttitallet av forrige århundre 42. Det ble ansett som en trygg og repeterbare teknikk for å studere den nedre luftveiene hos storfe. På grunn av mangel på tilstrekkelige data om Balf parametere i friske dyr, i 1988 Pringle et al. Utført BAL på friske kalver med en fleksibel fiberoptiske bronkoskop. Forfatterne pekte også på behovet for å standardisere BAL protokoller under eksperimentelle forhold til å tilegne seg sammenlignbare resultater 43. BAL brukes fortsatt som en in vivo prøvetakingsmetoden i kalver 44-46.Bronkial børsting er ofte brukt i human medisin som endiagnostisk verktøy for å smake neoplastiske lesjoner eller for mikrobiologisk analyse 36. For forskningsformål, kan primære cellekulturer av epitelceller høstes av cytologisk børsting fås 47. I kveg, har bruken av bronkial brushings for mikrobiologisk analyse blitt beskrevet for å karakterisere mikrobielle miljøet i lungen 43.
Transbronchial lunge biopsi gir lunge vevsprøver og er et verdifullt diagnostisk verktøy for diffuse lungesykdommer hos mennesker. Iatrogen pneumothorax og prosedyrerelaterte blødninger er komplikasjoner forbundet med denne teknikken. Deres forekomst er rapportert å være mindre enn én prosent i menneskelige pasienter 48. Transbronchial lunge biopsi er ikke en vanlig metode for bruk i storfe, på grunn av den høye kostnaden for utstyret som kreves og tiden det tar å få biopsier. I stedet transkutane lunge biopsi er mer praktisk under feltforhold 49-51.
En bronkoskopi-metode for inokulering ble utviklet og forskjellige bronkoskopi-samplingsmetoder er innrettet til å brukes i store dyr under eksperimentelle betingelser. De beskrevne teknikkene er lette å lære, selv for sensorer med liten erfaring i endoskopi. Prosessen med bronkoskopi er minimal invasiv og ingen skadelige effekter forbundet med fremgangsmåtene ifølge inokulering, så vel som de som er beskrevet metoder for prøvetaking (BAL, transbronchial lunge biopsi, bronkial børsting) ble sett i noen av dyrene. Komplikasjoner forbundet med transbronchial lunge biopsi hos mennesker er blødning og pneumothorax 48, ingen av disse ble sett i leggene som gjennomgikk denne prosedyren. Den transbronchial lunge biopsi er mer tidkrevende og krever mer utstyr enn transkutan metoden, men det er mindre invasiv og ikke bærer risikoen for sårinfeksjon.
Den visuelt kontrollert, endoskopisk metode for inoculation tillater avsetning av en definert mengde av patogen på bestemte områder av lungen. Dermed resulterer det i svært konsistente kliniske og patologiske funn i alle inokulerte dyr 32-34. Men det betyr ligner ikke alle funksjonene i naturlig infeksjon i leggene. I en modell av en respiratorisk C. psittaci-infeksjon, den beskrevne teknikken for vaksinasjon førte til lunge lesjoner assosiert med nettstedene til patogen plassering 34, mens i naturlig infeksjoner kalver vanligvis utvikler lungebetennelse av de apikale fliker. Dette faktum må tas i betraktning når man tolker relevansen av eksperimentelle funnene i sammenheng med naturlige ervervet lungeinfeksjoner hos storfe.
Videoendoskopisk BAL tillater prøvetaking et definert område av lungen. For eksperimentelle formål er dette en fordel i forhold til bruken av et nesekateter i henhold til blindbetingelser. På grunn av anatomien i bovin lunge, ville det blindt innsatt kateter være trykked til høyre magen lapp i de fleste tilfeller 53,54 og sensor har ingen innflytelse på det området av lungen som er lavaged. En annen fordel med endoskopisk BAL i bedøvede kalver i lateral recumbency er den høye gjennomsnittlige utvinningsgrad på innpodet fluid på mer enn 80%. En sammenligning med andre studier viser at, i stående, bedøvede kalver, en bedring på 133,3 ± 1,6 ml 46 og 127,13 ± 3,53 ml 45 etter drypping av 240 ml væske inn i hale lapp er rapportert. I sederte kalver i sternal recumbency 51% av den innpodet væske kunne utvinnes fra kranie lapp og 62% fra hale lobe 43. Det vil si at omtrent halvparten av den innpodet fluid kunne utvinnes i oppreist stilling på leggen. Avhengig av hvor mye Balf nødvendig for videre prøveopparbeidelse, dette kan ikke la nok materiale til å gjennomføre alle ønskede eksperimenter. BAL hos storfe har blitt brukt av mange forskningsgrupper og mangeulike parametre har blitt undersøkt under ulike forhold. De fleste forfattere utført kylling av de basale fliker 43,45,46, men mengden av væske som brukes til skylling skiller mellom forskningsgruppene. Dette fører til inkonsistens i fortynning av de gjenvundne celler, proteiner og andre stoffer, noe som gjør det vanskelig å sammenligne resultatene fra forskjellige publikasjoner. Derfor, for bruk i kveg er det anbefalt å lavage med fem fraksjoner på 20 ml (det vil si 100 ml totalt) kroppen varm, isotonisk saltløsning, som er utvunnet umiddelbart etter instillasjon. Når man bruker en lavage kateter med en stor diameter (dvs.> 2 mm), må volumet av hver fraksjon som skal noe økt, avhengig av mengden av væske som forblir i kateteret.
Den svært segmentert anatomi av storfe lunge fører til en metodisk begrensning; Resultatene som oppnås fra en del av lungen kan ikke være sant for resten av lungen. Siden det ikke er noensynet kontroll over hele lungen området undersøkt av transbronchial biopsi og kylling, kan sensor ikke vet om de samplet områdene var friske eller syke. Derfor er det svært viktig å prøve steder hvor patogenet ble inokulert før for å ha en høyere utvinningsgrad av organismen og for å ha en større mulighet for prøvetaking syke lungeområdene. En annen begrensning er økt bedøvelse risiko i dyr av dårlig klinisk tilstand. De beskrevne fremgangsmåter bør bare benyttes i modeller av mild til moderat sykdom for å holde belastningen for dyrene så lavt som mulig. Generell anestesi i drøvtyggere skal alltid holdes så korte som mulig, fordi gassutvikling i vomma øker bedøvelse risikoen i disse artene. Dyr må plasseres i liggende stilling umiddelbart etter bronkoskopi å tillate effluks av den utviklede gassen og må overvåkes nøye til de er helt restituert fra anestesi. Også de beskrevne teknikker er ikke suitagjengelig for prøvetaking intervaller på mindre enn 24 timer.
Den beskrevne protokollen kan tilpasses andre smittestoffer. Endoskopisk inokulering av forskjellige patogener har blitt beskrevet, for eksempel C. psittaci 32-34, Pasteur haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, og bovin virus diaré virus 44. Dessuten kan de steder av patogen innskudd i lungen være tilpasset den aktuelle modellen. Ved valg av prøvetakingssteder, noen viktige fakta må tas i betraktning: (i) prøvetakingssteder bør velges basert på plasseringen av vaksinasjonen og på de forventede patologiske funn. (Ii) Når obduksjon skal utføres omsorg må tas for å forlate nok Uprøvde lungeområder for ex vivo prøvetaking. (Iii) Prøvetaking nettstedet steder må velges slik at de kan nås med utstyret. Spesielt for transbronchial lunge biopsi, er det begrensninger på grunn av lengden av biopsitang. (Iv) Than rekkefølgen av prøvetaking er viktig, bronkial børsting og transbronchial lunge biopsi kan føre til mindre blødning, noe som ville forurense Balf. Derfor Balf må alltid innhentes først. Ved bruk av protokollen i andre arter, må artsspesifikke lunge anatomi tas i betraktning.
The authors have nothing to disclose.
The authors are very thankful to the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) of Germany for the funding of their work. Also, the authors thank Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel and all the other colleagues working in the team of the animal house (FLI, Germany) for their technical assistance with the bronchoscopies. They are very thankful to Maria-Christina Haase (FLI, Germany) for her help in providing literature. Furthermore, the authors wish to express their gratitude to Dr. Angela Berndt (FLI, Germany) and Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) for critical reading of the manuscript.
Veterinary Video Endoscope | Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany | PV-SG 22–140 | diameter: 9 mm, working channel: 2,2 mm, working length 140 cm |
lavage catheter | Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany | diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter | |
acuator | WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany | 32660 | length: 60 mm |
biopsy forceps | Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany | REF 60180LT | 1.8 mm, serrated, oval |
Omnifix 20 ml, Luer-Lock | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4617207V | |
cytology brush | mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany | 110240-10 | working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm |
iv acess | Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany | 370-211 | diameter 1.2 mm, length 43 mm |
Rompun 2% (xylazin) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 0.2 mg/kg bodyweight | |
Ketamin 10% (ketamine) | bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany | 2.0 mg/kg bodyweight | |
isotonic saline solution | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
SUB 6 waterbath | CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany | n/a | |
metal tube speculum | n/a | n/a | diameter: 3.5 cm, length: 35 cm |
flashlight | n/a | n/a | |
siliconized glass bottles | n/a | n/a | siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC) |
Omnifix Luer 3 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616025V | |
Omnifix Luer 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4616057V | |
sealing plugs | Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany | 900-3057 | |
inoculum | n/a | dilute pathogen in 8mL buffer |