qPCR formalin-तय, आयल एम्बेडेड बायोप्सी ऊतक में Cytomegaloviral डीएनए का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और तेजी से विधि है
Summary
This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.
Abstract
यह गंभीर संक्रमण के विकास के लिए उनके अधिक से अधिक जोखिम को देखते हुए, जठरांत्र (सैनिक) immunosuppressed रोगियों के पथ में cytomegalovirus (सीएमवी) के संक्रमण की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. सीएमवी संक्रमण का पता लगाने के लिए कई प्रयोगशाला तरीकों सीरम विज्ञान, वायरल संस्कृति, और आणविक विधियों सहित विकसित किया गया है. अक्सर, इन तरीकों के साथ सीएमवी प्रणालीगत भागीदारी को दर्शाते हैं और विशेष रूप से स्थानीय ऊतक भागीदारी की पहचान नहीं है. इसलिए, सैनिक पथ में सीएमवी संक्रमण का पता लगाने अक्सर बायोप्सी ऊतक के पारंपरिक ऊतक विज्ञान के द्वारा किया जाता है. Immunohistochemistry (आईएचसी) के साथ संयोजन के रूप में hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला इन बायोप्सी की जांच का मुख्य आधार बनी है. एच ई और आईएचसी कभी कभी व्याख्या मुश्किल है, जिससे असामान्य (गोलमोल) धुंधला पैटर्न में परिणाम. यह सीएमवी के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) सफलतापूर्वक बहुत लिए formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) बायोप्सी ऊतक पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि दिखाया गया थाउच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक नैदानिक प्रयोगशाला स्थापित करने में FFPE बायोप्सी ऊतक में सीएमवी का पता लगाने के लिए qPCR परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है. इस विधि सैनिक बायोप्सी में सीएमवी के लिए गोलमोल धुंधला के मामलों में रोगियों के लिए काफी लाभ होने की संभावना है.
Introduction
नैदानिक नमूनों में cytomegalovirus (सीएमवी) के संक्रमण की व्याख्या गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है. सीएमवी herpesviruses की betaherpesvirinae उपप्रजाति का एक सदस्य है. अन्य herpesviruses के लिए इसी प्रकार, सीएमवी सक्रिय वायरल प्रतिकृति 1 की कमी की विशेषता लगातार या अव्यक्त संक्रमण स्थापित करने की क्षमता है. वायरस के पुनर्सक्रियन रोग अभिव्यक्तियों 2-4 के साथ हो सकता है, जो virion रिहाई के द्वारा होती सक्रिय वायरल प्रतिकृति के लिए अग्रणी, तनाव या अन्य प्रतिरक्षादमन के समय के दौरान हो सकता है. जठरांत्र (सैनिक) सीएमवी रोग के लक्षण अक्सर पेट दर्द और / या खूनी दस्त शामिल हैं 1.
ऊतक विज्ञान द्वारा सीएमवी आंत्रशोथ का निदान hematoxylin और सीएमवी वायरल समावेशन की पहचान करने के लिए eosin (एच एंड ई) का इस्तेमाल करता है. नैदानिक संदेह उच्च अभी तक कोई स्पष्ट समावेशन मनाया जाता है जहां मामलों में, immunohistochemistry (आईएचसी) अक्सर एक सहायक परीक्षा पद्धति के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि, आईएचसीभी व्याख्या मुश्किल (चित्रा 2) 5, जिससे दुर्लभ गैर क्लासिक दिखने सेलुलर धुंधला पैटर्न (गोलमोल) द्वारा बाधा उत्पन्न किया जा सकता है. यह formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) सैनिक बायोप्सी ऊतक और सैनिक बायोप्सी में सीएमवी पता लगाने के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) से निकाले डीएनए का उपयोग करने की मांग की थी. इस तकनीक सैनिक बायोप्सी में सीएमवी का पता लगाने में बहुमूल्य होना दिखाया, और गोलमोल आईएचसी धुंधला मामलों 5,6 में विशेष रूप से उपयोगी है किया गया है. इसके अलावा, qPCR भी यह 6 उपलब्ध है जब अतिरिक्त नैदानिक सीएमवी परीक्षण डाटा के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी दिखाया गया है. सीएमवी का पता लगाने में qPCR का प्रयोग सीएमवी के लिए नैदानिक संदेह अधिक है जिन मामलों में पहले निदान और उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन एच ई और सीएमवी आईएचसी नकारात्मक हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
कई प्रयोगशाला तरीकों सीरम विज्ञान, वायरल संस्कृति, आणविक viremia assays, बायोप्सी सामग्री के ऊतक विज्ञान, और, formalin-तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) बायोप्सी का हाल ही में प्रदर्शन के रूप में, आणविक assays सहित cytomegalovirus का निदान (सीएमव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आंकड़े तैयार करने में उनके प्रयासों के लिए इस पांडुलिपि तैयार करने के साथ उसकी सहायता के लिए एमी Thomasson, और फ्रेड्रिक Skarstedt और रयान क्रिस्टी को स्वीकार करते हैं.
Materials
| 1.7 mL microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μL Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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