ट्रांसजेनिक कृंतक परख बढ़ाता पुरुष रोगाणु सेल उत्परिवर्ती आवृत्ति के लिए

Summary

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Abstract

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Introduction

Germline में छिटपुट डीएनए उत्परिवर्तन कम प्रजनन सफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और, विरासत में मिला है, तो वंश ^1-3 में कैंसर के लिए आनुवांशिक बीमारी या बढ़ गड़बड़ी हो सकती है. पर्याप्त सबूत डी नोवो म्यूटेशन का एक बड़ा हिस्सा पैतृक germline ⁴ से विरासत में मिला रहे हैं कि यह दर्शाता है, और संतानों में म्यूटेशन की संख्या सकारात्मक गर्भाधान ⁵ के समय पैतृक उम्र के साथ जोड़ा जाता है. पुरुष म्यूटेशन की उच्च अनुपात लिंगों के बीच gametogenesis दौरान उम्र में अंतर का एक परिणाम माना जा रहा है, महिला germline ² में oogenic कोशिका विभाजन की संख्या के साथ तुलना में spermatogenic कोशिका विभाजन की बड़ी संख्या है, और डीएनए में एक प्रगतिशील गिरावट पुरुषों में उम्र के साथ दक्षता में सुधार. इन सभी कारकों के पुरुष germline ⁶ में प्रतिकृति त्रुटियों की एक वृद्धि की संभावना के लिए योगदान करते हैं. हालांकि, पैतृक जोखिम के प्रभाव वातावरण कोनए सिरे से परिवर्तन की आवृत्ति पर nmental कारकों अनिश्चित बनी हुई है. फिर भी, पर्यावरण एजेंटों की एक बड़ी संख्या कृन्तकों ⁷ में जर्म सेल म्यूटेशन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, और इन एजेंटों में से कुछ भी मानव germline ⁸ को प्रभावित कर सकते हैं कि बढ़ते सबूत नहीं है. इन चिंताओं के बावजूद, रसायन नियमित नियामक उद्देश्यों के लिए दैहिक कोशिकाओं में उत्परिवर्तन के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए जांच की जाती है और यह आम तौर पर दैहिक परीक्षण germline की रक्षा करने के लिए पर्याप्त हैं कि माना जाता है. इसलिए, रसायन केवल शायद ही कभी रोगाणु सेल म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.

एक कारण यह रोगाणु सेल mutagenicity परीक्षण काफी हद तक विनियामक निर्णय लेने की प्रक्रिया से हटा दिया गया है व्यावहारिक तरीकों की कमी है. ऐसे प्रमुख ⁹ घातक और विशिष्ट लोकस ¹⁰ परीक्षण के रूप में पारंपरिक कृंतक आधारित विधियों, भ्रूण या की संतानों में उत्परिवर्ती phenotypes स्कोरिंग द्वारा रोगाणु सेल उत्परिवर्तन दर का अनुमानउजागर माता पिता. ये assays सांख्यिकीय सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए जानवरों, समय और संसाधनों की एक बहुत बड़ी संख्या के उपयोग की आवश्यकता है.

रोगाणु सेल उत्परिवर्तन बढ़ाता के लिए कई आधुनिक तरीकों हाल ही में उभरा है हालांकि, कई उनकी व्यावहारिकता, दक्षता, और जैविक प्रासंगिकता के संदर्भ में कमियों पीड़ित हैं. उदाहरण के लिए, विस्तारित सरल मिलकर दोहराएँ (ESTR) loci में लंबाई म्यूटेशन दोहराने एक अणु पीसीआर दृष्टिकोण ¹⁵ का उपयोग करते हुए पुरुष रोगाणु कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, इस पद्धति का निष्पादन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कठिन हो सकता है, और बिंदु उत्परिवर्तन के विपरीत, अत्यधिक अस्थिर ESTR loci के दोहराने की लंबाई में परिवर्तन के जैविक और स्वास्थ्य महत्व स्पष्ट नहीं ¹⁶ में रहते हैं. पैतृक म्यूटेशन ^4,17 की समस्या के लिए आवेदन किया है जब आधुनिक पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों जैविक रूप से सार्थक डेटा का खजाना प्रदान कर सकते हैं, लेकिन उच्च लागत, उच्च त्रुटि दर, जुड़े सत्यापन आवश्यकम्यूटेशन की पुष्टि, और जैव सूचना विज्ञान की चुनौतियों को अभी भी एक नियामक परीक्षण क्षमता ¹⁸ में इस विकल्प की दिनचर्या आवेदन सीमित करने के लिए.

इस के साथ साथ, हम ट्रांसजेनिक पुरुष चूहों के जर्म कोशिकाओं में सीधे प्रेरित म्यूटेशन बढ़ाता के लिए एक व्यावहारिक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल गुणसूत्र 3 ¹⁹ (चित्रा 1) के दोनों प्रतियों में एकीकृत एक Escherichia कोलाई lacZ रिपोर्टर जीन युक्त पुनः संयोजक λgt10 फेज वेक्टर के कई concatenated प्रतियां है जो ट्रांसजेनिक MutaMouse मॉडल, के लिए वर्णित है.

इस प्रोटोकॉल भी एक ही सिद्धांत (BigBlue माउस और चूहे, या lacZ प्लाज्मिड माउस, आदि.) या थोड़ा अलग रिपोर्टर जीन (GPT डेल्टा माउस और चूहे पर आधारित अन्य ट्रांसजेनिक कृंतक (TGR) मॉडल के लिए प्रासंगिक है, TGR मॉडल लैम्बर्ट एट में समीक्षा अल. ^20). इस पद्धति का एक हाल ही में जारी में वर्णित TGR उत्परिवर्तन परख पर आधारित हैऔर ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश ²¹ संशोधित और हम क्योंकि शुक्राणुजनन के अद्वितीय विशेषताओं के पुरुष germline में म्यूटेशन के आकलन को समायोजित करने के लिए आवश्यक विशेष विचार पर प्रकाश डालेंगे. संक्षेप में, परख पूर्व mutational घावों स्थिर म्यूटेशन में तय कर रहे हैं, जहां एक नमूने समय के बाद mutagenic पदार्थ को ट्रांसजेनिक पुरुष चूहे, उजागर करना शामिल है. चुना नमूना समय, चूहों euthanized हैं और रोगाणु कोशिकाओं पुच्छ अधिवृषण या बीजदार नलिकाओं या तो से एकत्र कर रहे हैं. नीचे चर्चा की, शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में mutagenic प्रभाव जोखिम और नमूना संग्रह के बीच समय का चयन करके निर्धारित किया जा सकता है. सेल प्रति λ फेज जीनोम की कई प्रतियां शामिल ट्रांसजेनिक सम्मिलित, जर्म सेल जीनोमिक डीएनए से अलग और फिर एक ई संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि संक्रामक λ फेज कण पैदा खाली λ फेज capsids में पैक कर रहे हैं कोलाई मेजबान. संक्रमित बैक्टीरिया selec पर हो रहे हैंजंगली प्रकार lacZ शरण कोशिकाओं से lacZ की एक उत्परिवर्तित प्रतिलिपि के साथ एक वेक्टर युक्त कोशिकाओं भेद कर सकते हैं कि सक्रिय मीडिया. पुरुष germline पर जोखिम की mutagenic प्रभाव (लैम्बर्ट एट अल. ²⁰ में समीक्षा चित्रा 2,) नियंत्रण और इलाज चूहों के बीच उत्परिवर्ती transgenes की आवृत्ति की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है. रोगाणु कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता जानवरों की संख्या कम है, जबकि पारंपरिक तरीकों पर इस परख बेहतर संवेदनशीलता देने, एक माउस से assayed किया जा सकता है. कोई विशेष उपकरण या प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और, क्योंकि इस परख सबसे आधुनिक विष विज्ञान / आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में जर्म सेल उत्परिवर्तन के परीक्षण के लिए एक व्यावहारिक और कुशल विकल्प प्रदान करता है.

TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख के प्रभावी आवेदन के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता spermatogenic चक्र (चित्रा 3) की समझ है. अनुसूचित जनजाति से प्रगति करने के लिए माउस रोगाणु कोशिकाओं के लिए समयअंत में spermatogonia, spermatocytes, spermatids, और बीजदार नलिकाओं में उन्हें कोशिकाओं (यानी. शुक्राणुजनन) लगभग 49 दिनों का है अधिवृषण में शुक्राणु परिपक्व करने के लिए. म्यूटेशन इस चक्र के विभिन्न चरणों में होते हैं और अक्सर यौगिक विशिष्ट है सकते हैं. पुरुष रोगाणु कोशिकाओं में mutagenesis के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं कि दो प्रमुख विशेषताएं जल्दी अर्धसूत्रीविभाजन दौरान डीएनए संश्लेषण की समाप्ति, और देर के बाद अर्धसूत्रीविभाजन दौरान डीएनए की मरम्मत की क्षमता ⁶ की प्रगतिशील हानि की प्रेरण और निर्धारण के लिए आवश्यक हैं कि दो प्रक्रियाओं हैं सबसे म्यूटेशन.

क्योंकि शुक्राणुजनन की इन अनूठी विशेषताओं की, TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख के संचालन के लिए तीन महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चर रहे हैं: (1) परीक्षण परिसर प्रशासन समय; (2) नमूने समय; और (3) रोगाणु सेल की आबादी का चयन विश्लेषण (चित्रा 3 और 1 टेबल) के लिए इकट्ठा करने के लिए. प्रशासन समय experime हैलंबे समय से लक्ष्य कोशिकाओं परीक्षण यौगिकों को उजागर कर रहे हैं कि कैसे निर्धारित करता है कि ntal चर. प्रशासन समय की लंबाई भी विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या शुक्राणुजनन के चरणों के जोखिम को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक ही दिन प्रशासन एक विशेष सेल प्रकार पर एक तीव्र जोखिम के प्रभावों का निर्धारण किया जा सकता है. इसी तरह, जोखिम केवल meiotically विभाजित spermatocytes को लक्षित, या mitotically एक 2 सप्ताह प्रशासन समय और एक उपयुक्त नमूने समय का उपयोग spermatogonia विभाजित करके उदाहरण के लिए, एक पूरे spermatogenic चरण के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. पुरानी और उप जीर्ण प्रशासन बार परीक्षण परिसर के पर्याप्त फार्माकोकाइनेटिक वितरण सुनिश्चित करने, या 28 दिन प्रशासन समय ओईसीडी परीक्षण में सिफारिश उदाहरण के लिए कमजोर उत्परिवर्तजन से म्यूटेशन की पर्याप्त संचय (अनुमति देने के लिए, लंबी अवधि के जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है दिशानिर्देश).

नमूने समय का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण चर रहा है, जिस परशुक्राणुजनन के चरण लक्ष्य कोशिकाओं जोखिम के समय में थे. नमूने समय कितना समय पैदा करती है, और इसलिए कितना आगे spermatogenic चक्र के साथ, कोशिकाओं प्रदर्शन के बाद के माध्यम से गुजरती हैं. उदाहरण के लिए, स्टेम सेल spermatogonia में प्रभाव की जांच के लिए एक नमूना समय> 49 दिन> 42 दिनों के लिए पूरी तरह से परिपक्व शुक्राणु एकत्रित यदि आवश्यक है, या सब एकत्र कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, बीजदार नलिकाओं से अपरिपक्व रोगाणु कोशिकाओं को इकट्ठा अगर उजागर से विकसित कोशिकाओं उपजा है. यह कम से कम 70 दिनों का एक नमूना समय शुक्राणुजनन के बाद के चरणों में उजागर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए, विषैला की फार्माकोकाइनेटिक वितरण के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध कराने के लिए एक सच्चे स्टेम सेल प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए बेहतर होगा, और के लिए खाते में है कि नोट करना महत्वपूर्ण है अत्यधिक mutagenic यौगिकों ²² को प्रदर्शन के बाद ~ 6 सप्ताह हो सकता है कि अस्थायी बाँझपन की अवधि. इसी प्रकार, 21 दिनों के नमूने समय है कि शुक्राणु Colle सुनिश्चित करेगीपुच्छ अधिवृषण से cted सिर्फ जोखिम के अंतिम दिन पर अर्धसूत्रीविभाजन पूरा कर लिया जाएगा.

जर्म कोशिकाओं पुच्छ अधिवृषण से, या बीजदार नलिकाओं से विभिन्न spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण के रूप में परिपक्व शुक्राणु के रूप में एकत्र किया जा सकता है. परिपक्व शुक्राणु सापेक्ष सटीकता शुक्राणु किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए उत्पन्न जिसमें से शुक्राणुजनन की सेल प्रकार या चरण के साथ निर्धारित करने के लिए यह संभव बनाने, ~ 3 दिन के लिए पुच्छ में रहते हैं. इस प्रकार, पुच्छ शुक्राणु परमिट का विश्लेषण अत्यधिक चरण विशिष्ट mutational प्रभाव की जांच को निशाना बनाया. दूसरी ओर, बीजदार नलिकाओं से एकत्र सेल निलंबन विकास के विभिन्न चरणों में विभिन्न रोगाणु सेल प्रकार के एक मिश्रण होते हैं, और इस तरह उत्परिवर्तन उत्पन्न जिसमें spermatogenic चरण के गरीब संकल्प प्रदान करते हैं. इसके अलावा, बीजदार नलिकाओं से बरामद सेल निलंबन एक spermatocytes द्वारा पीछा spermatids का अधिक प्रतिनिधित्व,, और देखें शामिल करने के लिए करते हैंवाई कुछ spermatogonia और स्टेम सेल (इन अनुपात चित्रा 3 में स्नातक की उपाधि सफेद सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं). इसके अलावा, बीजदार नलिकाओं से तैयार निलंबन भी विभिन्न दैहिक कोशिकाओं को नियंत्रित कर सकते. इतने सारे कोशिकाओं प्रकार मौजूद हैं, क्योंकि इस प्रकार, mutational प्रभाव गैर लक्ष्य कोशिकाओं की एक किस्म से प्रभावित किया जा सकता है. हालांकि, बीजदार नलिकाओं से नमूने एकत्र करने के लिए एक साथ कई रोगाणु सेल प्रकार, और दैहिक उत्परिवर्तन के लिए मानक ओईसीडी परीक्षण प्रोटोकॉल में जर्म सेल विश्लेषण के आसान एकीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक किफायती विकल्प प्रदान करता है.

अन्वेषक, प्रशासन समय, नमूने समय और एकत्र सेल की आबादी की जरूरतों पर निर्भर करता है, दोहराना करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में और शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में जोखिम के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. ध्यान से इन चर का चयन करके, प्रयोगों, या अधिक सामान्यीकृत विनियामक परीक्षण के लिए लक्षित यंत्रवत अध्ययनों के लिए तैयार किया जा सकता हैप्रयोजनों आईएनजी.

परख में प्रवीणता प्राप्त करने के लिए, हम एक 70 दिन नमूने समय के रूप में सकारात्मक नियंत्रण द्वारा पीछा / किलो एन एथिल-N-nitrosourea 100 मिलीग्राम (ENU) की एक तीव्र मौखिक प्रशासन के उपयोग, सलाह देते हैं. पुच्छ शुक्राणु का विश्लेषण इस प्रकार आम तौर पर ENU के इस अत्यधिक mutagenic खुराक के बाद नियंत्रण खत्म उत्परिवर्ती आवृत्ति (एमएफ) में 4-5 गुना वृद्धि का प्रदर्शन जो spermatogonial स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 3), लक्ष्य. यह इस प्रकार यह छोटा नमूना समय के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण खुराक नहीं हो सकता है, इस खुराक बाँझपन 6 सप्ताह जोखिम पोस्ट प्रेरित करने के लिए जाना जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस खुराक भी सबसे दैहिक ऊतकों ²⁰ में म्यूचुअल फंड में एक detectable वृद्धि का उत्पादन होगा. नीचे प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम के लिए और 100 मिलीग्राम / किग्रा सहित ENU की तीन खुराक का उपयोग करते हुए एक तीव्र +70 जोखिम आहार निम्नलिखित उत्पन्न किया गया.

Protocol

पशुपालन, रखरखाव और हैंडलिंग से जुड़े सभी प्रोटोकॉल स्वास्थ्य कनाडा के जानवरों की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. 1 पशु निवेश जोखिम बेतरतीब ढंग से चुनी प्रशासन समय के लिए एक उपयुक्त जोखिम मार्ग द्वारा परीक्षण परिसर और प्रासंगिक नियंत्रण के साथ समूहों और उपचार समूहों (न्यूनतम समूह प्रति = 5) .Treat चूहों पर नियंत्रण करने के लिए (8-12 सप्ताह पुराने) ट्रांसजेनिक पुरुष चूहों वितरित. ब्याज की spermatogenic सेल प्रकार (चित्रा 3) के अनुसार उपयुक्त नमूने समय चुनें. नमूने समय के बाद, isofluorane संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (या अन्य उपयुक्त विधि) द्वारा चूहों euthanize. ध्यान से पुच्छ epididymides पेट या अंडकोश की थैली में एक चीरा से वृषण आकर्षित और आबकारी. (चित्रा 4, अधिवृषण संग्रह की एक विस्तृत वीडियो देखने Duselis एट अल. 24 देखने के लिए). बीजदार छोटी नली का विश्लेषण अगर वैकल्पिक रूप से, वृषण इकट्ठाकोशिकाओं. बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में रुक. 2 अलगाव और पाचन पुच्छ शुक्राणु की बर्फ पर पुच्छ अधिवृषण Defrost. एक पेट्री डिश thawed पुच्छ स्थानांतरण और अच्छी तरह से एक स्केलपेल या रेजर ब्लेड के साथ कीमा. पेट्री डिश कमरे के तापमान डी पीबीएस के 700 μl जोड़ें. ड्राइंग और डी पीबीएस शुक्राणु (लगभग 10 बार) के साथ बादल बन जाता है जब तक निलंबन जारी करके पुच्छ से एक विस्तृत बोर 1000 μl विंदुक टिप, रिलीज शुक्राणु का उपयोग करना. नोट: विस्तृत बोर विंदुक टिप तैयार करने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट टिप के अंत से 2-3 मिमी काटा. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक स्टेनलेस स्टील के जाल फिल्टर के माध्यम से फिल्टर निलंबन. डी पीबीएस के एक अतिरिक्त 700 μl के साथ पेट्री डिश धोने और जाल फिल्टर के माध्यम से ही 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण. बर्फ पर ट्यूब जगह, जाल निकालें. दोहराएँ शेष नमूनों के लिए 2.1-2.3 कदम. 3 मिनट के लिए 11,000 XG samplesat स्पिन. ध्यान से छानना सतह पर तैरनेवाला. गोली परेशान करने से बचें. 1.0 मिलीलीटर ठंड 1x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) जोड़ें. गोली तक भंवर पूरी तरह से फिर से निलंबित कर दिया है. यह कभी कभी vortexing के कई दौर ले जाएगा. 10% एसडीएस के 15 μl जोड़ें. उलटा / गैर शुक्राणु कोशिकाओं को बाधित करने के लिए 30 सेकंड के लिए सख्ती से हिला. बहुत धीरे हिलती अपर्याप्त विघटन का परिणाम देगा और गोली निम्नलिखित कदम में ठीक से फार्म नहीं होगा. 2 मिनट के लिए 11,000 XG पर स्पिन. एक ढीला, "शराबी" गोली कारण अपर्याप्त कदम 2.7 में मिलाते तक दैहिक कोशिकाओं का अधूरा विघटन का सूचक है. यदि ऐसा होता है, बस फिर नमूना हिला, और एक तंग गोली बनाई है जब तक respin. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना. गोली परेशान करने से बचें. संक्षेप में फिर से स्पिन और 200 μl विंदुक के साथ शेष सतह पर तैरनेवाला हटायें. गोली resuspended है जब तक 940 μl 0.2x ठंड एसएससी और भंवर जोड़ें. इस गोली फिर से निलंबित करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है और vortexing के कई दौर ले सकते हैं. एस के कभी कभी clumpsपर्म अपरिहार्य हैं. 120 μl β-mercaptoethanol, 100 μl 10% एसडीएस, 20 μl 0.5M EDTA, पीएच 8, और 20 μl proteinase कश्मीर (60 मिलीग्राम / एमएल, ताजा तैयार) जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ रात भर पचा. फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें. पुच्छ शुक्राणु से डीएनए के 3 Phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण नोट: देर चरण spermatids और परिपक्व शुक्राणु में परमाणु डीएनए protamines साथ complexed है, और अत्यधिक दैहिक कोशिकाओं के डीएनए की तुलना में सघन है, क्योंकि पारंपरिक न्यूक्लिक एसिड अलगाव तरीकों उत्परिवर्तन परख काम करने के लिए पर्याप्त उपज और पवित्रता का डीएनए उत्पन्न नहीं होगा कुशलतापूर्वक. एक आक्रामक पाचन के बाद एकाधिक फिनोल के क्लोरोफॉर्म एक्सट्रैक्शन जारी है और (15 से तरीकों पर आधारित) शुक्राणु डीएनए को शुद्ध करने के लिए आवश्यक हैं. स्थानांतरण शुक्राणु सेल एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब को पचाने. क्लोरोफॉर्म मिश्रण: फिनोल के 2 मिलीलीटर जोड़ें (1: 1). 22 rpm पर ट्यूब घुमाएँ3 मिनट के लिए. 10 मिनट के लिए 1600 XG पर अपकेंद्रित्र और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब को फजी इंटरफेस परत के साथ जलीय ऊपर परत हस्तांतरण. दोहराएँ 3.1.2 और 3.1.3 3x, लेकिन क्रमशः 3 मिनट, 4 मिनट, और 6 मिनट, रोटेशन बार बदलते कदम. अंतिम दोहराने पर, "फजी" इंटरफेस परत के किसी भी स्थानांतरित करने से बचें. Isoamyl शराब (24: 1) 4 वें निकासी के बाद, 3M एनएएसी, 5.2 पीएच 1 प्रति जलीय निकालने की मिलीलीटर और क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर की 70 μl जोड़ें. 12 मिनट के लिए 22 rpm पर ट्यूब घुमाएँ. 10 मिनट के लिए 1600 XG पर अपकेंद्रित्र और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब जलीय ऊपर परत हस्तांतरण. पूर्ण इथेनॉल के 2 संस्करणों को जोड़ने और धीरे कोमल कमाल के साथ अपने पक्ष पर ट्यूब घूर्णन द्वारा डीएनए वेग. एक गर्मी सील चारागाह पिपेट की नोक पर spooling से डीएनए एकत्र. 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल और शुष्क हवा में pipet टिप घूमता द्वारा डीएनए कुल्ला. 100 μl त्रि – निष्कर्षण के बाद, 40 में डीएनए वेग भंगएस EDTA बफर, पीएच 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 स्टोर. डीएनए lacZ उत्परिवर्तन परख करने के लिए आगे बढ़ने से पहले दो दिनों की एक न्यूनतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस भंग करने की अनुमति. घुलनशीलता मुद्दों का सामना कर रहे हैं, डीएनए आगे उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर भंग किया जा सकता है. एक 260 पर एक spectrophotometre साथ डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण और भंग डीएनए की एकाग्रता 200-2,000 एनजी / μl के बीच है कि यह सुनिश्चित करें. बीजदार नलिकाओं से जर्म कोशिकाओं के 4 अलगाव और पाचन जमे हुए हैं, बर्फ पर (लगभग 1 घंटा) वृषण defrost. स्थानांतरण एक जमीन गिलास प्लेट को वृषण. संदंश की एक जोड़ी के साथ वृषण के एक छोर पकड़. वृषण के दूसरे छोर पर, संदंश की एक और जोड़ी या विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी (चित्रा 5A) का उपयोग उपकला कैप्सूल में एक छेद पंचर. पंचर के माध्यम से बीजदार नलिकाओं निचोड़ और उपकला कैप्सूल (चित्रा 5 ब) त्यागें. एकडीडी decapsulated बीजदार नलिकाओं को कमरे के तापमान डी पीबीएस के 500 μl. कोण एक ऊतक रोलर इतना है कि एक छोर 5-10 ° (चित्रा 5C) की एक अनुमानित कोण पर थाली के साथ संपर्क में है (सिलिकॉन रबर कसकर एक स्वतंत्र रूप से घूर्णन 5 मिमी व्यास स्टेनलेस स्टील ट्यूब, या इसी तरह के तंत्र से अधिक फिट). किसी भी दबाव लागू किए बिना, धीरे वे चपटा कर रहे हैं जब तक नलिकाओं भर में आगे और पीछे रोलर चाल और डी पीबीएस जारी कोशिकाओं (लगभग 5-10x) के साथ बादल बन जाता है. कुछ अतिरिक्त टाइम्स नलिकाओं से अधिक डी पीबीएस की एक और 500 μl जोड़ें और धीरे नलिकाओं पर रोल. स्थानांतरित किया जा रहा अलग नलिकाओं की राशि (चित्रा 5D) जबकि कम से कम एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. दोहराएँ यदि आवश्यक हो तो अधिक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 4.5-4.6 कदम. किसी भी गलती से एकत्र नलिकाओं ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए 2 मिनट – 1 की अनुमति दें. एक fr डी पीबीएस स्थानांतरणबसे नलिकाओं (डी पीबीएस के लगभग 100 μl) के पीछे जा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ESH. इस निलंबन के एक छोटे से विभाज्य सेल की आबादी की संरचना का आकलन करने के लिए एक माइक्रोस्कोप (चरण विपरीत) के तहत जाँच की जा सकती. 30 सेकंड के लिए 11,000 XG पर कोशिकाओं स्पिन. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला छानना. यदि आवश्यक हो तो सेल गोली इस बिंदु पर -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है. यदि आवश्यक कोशिकाओं पिघलना. Lysis बफर के 5 एमएल में एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब और resuspend कोशिकाओं पर स्थानांतरण (10 मिमी Tris 7.6 पीएच, 10 मिमी EDTA, 100 मिमी NaCl, 1 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर, 1% एसडीएस). रातोंरात रोटेशन के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्ट. फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें. बीजदार छोटी नली जर्म कोशिकाओं से 5 Phenol डीएनए की / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण ध्यान दें: एक कम आक्रामक निष्कर्षण इन प्रकार की कोशिकाओं अभी तक एन के माध्यम से प्रगति नहीं किया है, बीजदार नलिकाओं रोगाणु सेल के डीएनए को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता हैuclear संक्षेपण. क्लोरोफॉर्म मिश्रण (1: 1) को रातोंरात बीजदार tubules सेल पाचन फिनोल के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 20 मिनट के लिए 22 rpm पर ट्यूब घुमाएँ. 10 मिनट के लिए 1600 XG पर अपकेंद्रित्र और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब, "फजी" इंटरफेस परत से परहेज करते हुए, जलीय ऊपर परत हस्तांतरण. 5 मिलीलीटर प्रति जलीय निकालने 5 एम NaCl के 100 μl जोड़ें (आमतौर पर 5 मिलीलीटर बरामद किया है) Isoamylalcohol: क्लोरोफॉर्म की 5 मिलीलीटर जोड़ें (24: 1). 12 मिनट के लिए 22 rpm पर ट्यूब घुमाएँ. 10 मिनट के लिए 1600 XG पर अपकेंद्रित्र और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब जलीय ऊपर परत हस्तांतरण. पूर्ण इथेनॉल के 2 संस्करणों को जोड़ने और धीरे घूर्णन और ट्यूबों inverting द्वारा डीएनए वेग. एक सील बंद चारागाह पिपेट की नोक पर spooling से डीएनए एकत्र. 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल और शुष्क हवा में pipet टिप घूमता द्वारा डीएनए कुल्ला. 40-100 μl Tris-EDTA बफर, पीएच 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 स्टोर में डीएनए भंग. डीएनए दो की एक न्यूनतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस भंग करने की अनुमतिदिन lacZ उत्परिवर्तन परख करने के लिए आगे बढ़ने से पहले (कदम 3.9 देखें). घुलनशीलता मुद्दों का सामना कर रहे हैं, डीएनए आगे उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर भंग किया जा सकता है. एक 260 पर एक spectrophotometre साथ डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण और एकाग्रता 200 और 2,000 एनजी / μl के बीच है कि यह सुनिश्चित करें. 6 lacZ उत्परिवर्तन परख बैक्टीरियल या फंगल संदूषण पैकेजिंग दक्षता, साथ ही पट्टिका विकास और स्कोरिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. यह पैकेजिंग प्रतिक्रिया, मेजबान संस्कृति और विकास मीडिया के प्रदूषण को रोकने के लिए उचित सड़न रोकनेवाला उपायों का उपयोग lacZ परख प्रदर्शन करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. दिवस परख पहले: निचला अग्रवाल और रातोंरात संस्कृति तैयार आठ प्लेटों प्रत्येक नमूना प्रति आवश्यक हैं अगर 8 मिलीलीटर नीचे वाले (4 प्लेटें अनुमापांक गिनती करने के लिए, 4 प्लेटें म्यूटेंट स्कोर करने के लिए) (यानी., 64 मिलीग्राम प्रति नमूना). नीचे अगर दोनों के लिए समान हैउत्परिवर्ती और अनुमापांक गणना प्लेटें. नमूनों की संख्या कार्रवाई की जा रही के लिए पर्याप्त नीचे अगर तैयार करें. Aseptically 90 मिमी पेट्री डिश (पकवान प्रति 8 मिलीग्राम) में डाल देना और अगर जमना करने की अनुमति. नोट: निचला अगर प्लेट अग्रिम में 1 सप्ताह के लिए तैयार किया जा सकता है. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर लेग शोरबा, 20% माल्टोज़ समाधान के 100 μl, 25 μl एम्पीसिलीन (20 मिलीग्राम / एमएल) और 20 μl kanamycin (5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने. ई के साथ टीका लगाना कोली (lacZ – / आंधी -) 25 और 240 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हो जाना. दिन 1: उप संस्कृति प्रकोष्ठों ताजा पौंड (कोई एंटीबायोटिक दवाओं) में रातोंरात संस्कृति की 100 कमजोर पड़ने: एक 1 तैयार करके उप संस्कृति कोशिकाओं. उपसंस्कृति के 8 मिलीलीटर की मात्रा प्रति नमूना की जरूरत है. आयुध डिपो 600 = 1 तक के बारे में 3.5 घंटे के लिए 240 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. जब आयुध डिपो 600 = 1, 10 के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर 1300 XG पर विभाजित सेल 50 मिलीलीटर ट्यूब में समान रूप से निलंबन और अपकेंद्रित्रमि. सतह पर तैरनेवाला निकालें और (यानी., नमूना प्रति 4 मिलीलीटर) लेग के 10 मिमी 4 MgSO युक्त मूल मात्रा का आधा में कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं. [कदम 6.2.4.3] की जरूरत तक अलग कोशिकाओं रखो. दिन 1: लैम्ब्डा फेज कणों में डीएनए पैकेजिंग 30 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान गरम. एक विस्तृत बोर 10 μl विंदुक टिप, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण 4 μl डीएनए का उपयोग करना. नोट: इस कदम की तैयारी के समय को कम करने के लिए अग्रिम में एक दिन या अधिक किया जा सकता है. एक फेज पैकेजिंग निकालने किट से पहले ट्यूब (लाल) (हर 2 नमूने के लिए 1 ट्यूब) गरम. संक्षेप में ट्यूब के नीचे निकालने इकट्ठा करने के लिए स्पिन. डीएनए नमूने के लिए सबसे पहले ट्यूब से पैकेजिंग निकालने के 4.8 μl स्थानांतरण और पिपेट टिप के साथ कोमल सरगर्मी से मिश्रण. संक्षेप में ट्यूबों में नमूने नीचे स्पिन. 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1.5 घंटे के लिए सेते हैं. दूसरा (नीला) पैकेजिंग निकालने ट्यूब (~ 15 नमूने लिए 1 ट्यूब) गरम. संक्षेप तल पर निकालने के लिए इकट्ठा करने के लिए स्पिनट्यूब की. डीएनए नमूने के लिए दूसरा ट्यूब से पैकेजिंग निकालने के 4.8 μl स्थानांतरण और कोमल सरगर्मी से मिश्रण. संक्षेप में ट्यूबों में नमूने नीचे स्पिन. 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक अतिरिक्त 1.5 घंटे के लिए सेते हैं. 500 μl एसएम बफर में पैक फेज कणों पुनः निलंबित और 20 rpm पर 30 मिनट के लिए घूर्णन द्वारा मिश्रण. ट्यूब के तल पर नमूने एकत्र करने के लिए 30 सेकंड के लिए 11,000 XG पर, संक्षेप में भंवर नमूने और अपकेंद्रित्र घुमाने के बाद. फेज कणों संक्रमण [कदम 6.2.4] के लिए तैयार हैं. दिन 1: शीर्ष अग्रवाल की तैयारी अनुमापांक प्लेटें और उत्परिवर्ती चयन प्लेटों के लिए अलग शीर्ष अगर तैयार करें. प्रत्येक नमूना 4 अनुमापांक प्लेटें, और 4 उत्परिवर्ती प्लेटों की आवश्यकता है. प्रत्येक थाली 8 मिलीग्राम शीर्ष अगर आवश्यकता है. केवल अगर उत्परिवर्ती चयन शीर्ष पर चयनात्मक एजेंट फिनाइल-β-D-galactopyranoside (पी लड़की) जोड़ें. दोनों शीर्ष agars अग्रिम में (परख के दिन) को तैयार है और दोनों शीर्ष agars को 4 MgSO जोड़ने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने, और पीजीअल चयन अगर उत्परिवर्ती लिए. दिन 1: पैक फेज और चढ़ाना के साथ संक्रमण प्रकोष्ठों नमूना प्रति दो 50 मिलीलीटर ट्यूब लेबल: नमूना प्रति 1 "उत्परिवर्ती" ट्यूब और नमूना प्रति 1 "अनुमापांक" ट्यूब नमूना प्रति 4 "उत्परिवर्ती" प्लेटें और नमूना प्रति 4 "अनुमापांक" प्लेटों: नमूना प्रति प्लेटें अगर लेबल 8 विभाज्य प्रत्येक ट्यूब [कदम 6.2.1.2 से] resuspended कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर. करने के लिए "उत्परिवर्ती" 50 मिलीलीटर ट्यूब (युक्त कोशिकाओं) [कदम 6.2.2.8 से] पैक फेज कणों की 500 μl जोड़ें. धीरे मिश्रण और फेज कणों कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति देते हैं. 30 मिनट के बाद, संक्षेप में भंवर कोशिकाओं को संक्रमित और (कोशिकाओं से युक्त) उचित 50 मिलीलीटर "अनुमापांक" ट्यूब को संक्रमित कोशिकाओं के 15 μl हस्तांतरण. थाली अनुमापांक नमूने के लिए, गर्म (50 डिग्री सेल्सियस) "अनुमापांक" शीर्ष अगर (जिनमें नहीं पी लड़की) को "अनुमापांक" 50 मिलीलीटर ट्यूब की 30 मिलीलीटर जोड़ें. तुरंत distrib4 "अनुमापांक" प्लेटों के बीच ute अगर / सेल मिश्रण (~ प्लेट प्रति 8 मिलीलीटर). शीर्ष अगर pipettes में शांत, और हवा बुलबुले परिचय नहीं की कोशिश नहीं करता कि इतनी जल्दी काम करते हैं. अगले "उत्परिवर्ती" नमूने प्लेट. पी लड़की "उत्परिवर्ती चयन" शीर्ष अगर में जोड़ा जाता है सुनिश्चित करें. गर्म "उत्परिवर्ती चयन" अगर (युक्त पी लड़की) को "उत्परिवर्ती" 50 मिलीलीटर ट्यूब के 30 मिलीलीटर जोड़ें. तुरंत (~ प्लेट प्रति 8 मिलीग्राम) 4 "उत्परिवर्ती" प्लेटों के बीच में अगर / सेल मिश्रण वितरित. प्लेटें तो (~ 15 मिनट) जमना पलटना और रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें. दिन 2: गिनती सजीले रातोंरात ऊष्मायन के बाद, उत्परिवर्ती और अनुमापांक प्लेटों पर सजीले टुकड़े की संख्या गिनती. सजीले टुकड़े की बड़ी संख्या के लिए, कुल गिनती अनुमान लगाने के लिए थाली के केवल एक हिस्से गिनती (जैसे., अक्सर ¼ अनुमापांक थाली के 100-200 के बीच सजीले होगा). 100 सजीले टुकड़े की एक न्यूनतम जब cou प्लेट प्रति गिना जाना चाहिएप्लेट के एक हिस्से nting. कोशिकाओं की μl प्रति पट्टिका गठन इकाइयों (PFUs) की संख्या की गणना. इस चढ़ाया कोशिकाओं की मात्रा (15 μl) द्वारा "अनुमापांक" प्लेटों पर सजीले टुकड़े की संख्या से विभाजित करके किया जाता है. / Μl "उत्परिवर्ती" प्लेट (PFUs / μl * पर चढ़ाया संक्रमित कोशिकाओं की कुल मात्रा में PFUs की कुल संख्या का अनुमान लगाने के PFUs की संख्या का प्रयोग करें [2 मिलीलीटर कोशिकाओं 0.5 मिलीलीटर पैक फेज कणों – अनुमापांक प्लेटों के लिए 15 μl] ). "अनुमापांक" प्लेटों से निर्धारित संक्रमित कोशिकाओं की कुल मात्रा में PFUs की अनुमानित कुल संख्या से 4 "उत्परिवर्ती" प्लेटों पर गिना उत्परिवर्ती सजीले टुकड़े की कुल संख्या से विभाजित करके म्यूचुअल फंड का अनुमान है. यह MutaMouse रोगाणु कोशिकाओं के लिए, ओईसीडी दिशानिर्देश जानवर हो स्क्रीन प्रति 125,000 300,000 के लिए गैर उत्परिवर्ती PFUs की एक न्यूनतम सिफारिश के रूप में सहज lacZ शेयरों में नियंत्रण समूह में 3 एक्स 10 -5, के क्रम में हैएक विश्वसनीय आधारभूत संकेत प्राप्त करने के क्रम में उत्परिवर्तन के लिए एड. अन्य ट्रांसजेनिक मॉडल PFUs की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी, जो मामले में कम सहज एमएफ, हो सकता है. एक सांख्यिकीय शक्ति परीक्षण वांछित संकल्प प्राप्त करने के लिए आवश्यक PFUs और जानवरों की न्यूनतम संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है. कई replicates से डाटा, इस न्यूनतम pfu आवश्यकता को पूरा करने के लिए जमा वे काफी अलग उत्परिवर्ती आवृत्तियों का उत्पादन नहीं करते प्रदान की जा सकती है. 7 सांख्यिकी विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक इकाई माउस है. इस परख से उत्पादित डेटा आम तौर पर सामान्य रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं. जैसे, डेटा का वितरण विशेषता के आधार पर विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय विधि का चयन करें. नोट: उपयुक्त डेटा परिवर्तन observa की रेंज भर में प्रतिक्रिया के विचरण बराबर करने के लिए लागू किया जाता है तो मानक पैरामीट्रिक विश्लेषण (. जैसे, एनोवा) नियोजित किया जा सकता हैtion. पॉसों या द्विपद प्रतिगमन विश्लेषण अक्सर अधिक उपयुक्त हैं. Nonparametric विश्लेषण भी नियोजित किया जा सकता है. हम नियमित सामान्यीकृत रेखीय मॉडल प्रक्रिया का उपयोग कर पॉसों प्रतिगमन रोजगार (यानी., प्रोक GENMOD) Lemieux एट अल 26 द्वारा वर्णित के रूप में एसएएस v.9.2 में (एसएएस संस्थान, Cary, नेकां).

Representative Results

पशु प्रति 200,000 सजीले टुकड़े के एक औसत पट्टिका गिनती के साथ, हम आम तौर पर हमारे नियंत्रण समूहों में 1.7 x 10 -5 के एक मानक विचलन के साथ लगभग 2.8 x 10 -5 पुरुष रोगाणु कोशिकाओं में से एक मतलब पृष्ठभूमि शेयरों में निरीक्षण (स्वतंत्र आठ से डेटा पर आधारित प्रयोगों). एन = 5 जानवरों के साथ इस पट्टिका गिनती, पृष्ठभूमि स्तर और विचरण, खुराक समूहों के साथ प्रत्येक शक्ति> 0.8 के साथ आप शेयरों में एक 2 गुना वृद्धि का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं. परिणाम आम तौर पर 2 टेबल और चित्रा 6 0 का एक भी तीव्र मौखिक खुराक, 25, 50 से अवगत कराया MutaMouse पुरुषों के पुच्छ शुक्राणु (एन = समूह प्रति 5) से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. सारणीबद्ध या चित्रमय स्वरूपों में सूचना दी, और 100 मिलीग्राम / किलो रहे एक 70 दिन नमूना समय से पीछा एन एथिल-N-nitrosourea (ENU). इस 70 दिन की अवधि के जोखिम के समय में spermatogonial स्टेम कोशिकाओं थे कि शुक्राणु में हुई mutational घटनाओं की माप (चित्रा 3 परमिट). उत्परिवर्ती और अनुमापांक प्लेटों पर विशिष्ट पट्टिका घनत्व चित्रा 7 में दिखाया जाता है. तालिका 2 और चित्रा 6 में दर्शाया के रूप में, तीव्र ENU जोखिम spermatogonial स्टेम सेल के शेयरों में में एक महत्वपूर्ण खुराक पर निर्भर वृद्धि प्रेरित किया. कम खुराक 2.6 x 10 -5 के एक आधारभूत शेयरों में था जो नियंत्रण पर एक महत्वपूर्ण 2.6 गुना वृद्धि हुई है, प्रेरित किया. अधिकतम प्रेरण नियंत्रण पर एक 4.4 गुना वृद्धि हासिल है, जो उच्च खुराक में हुई. बीजदार छोटी नली जर्म कोशिकाओं पर प्रदर्शन इस परख का एक उदाहरण डगलस एट अल. 27, म्यूचुअल फंड / किलो ENU 50 मिलीग्राम की एक 5 दिन दोहराने intraperitoneal इंजेक्शन के बाद विभिन्न समय अंतराल पर छोटी नली रोगाणु कोशिकाओं में निर्धारित किया गया था, जहां में पाया जा सकता है. कि अध्ययन में, बीजदार कोशिकाओं में उत्परिवर्ती आवृत्तियों उपचार के बाद 15 दिनों के लिए बढ़ी हुई और उसके बाद स्थिर बने रहे. एक्सपोसुनिश्चित करें परहेज एकत्र ऊतक एकत्रित सेल प्रकार (लक्ष्य सेल) जोखिम की शुरुआत में लक्ष्य सेल के चरण चरण प्रदर्शन के दौरान पारित एक्यूट 70 पुच्छ परिपक्व शुक्राणु स्टेम सेल स्टेम सेल 14 + 21 पुच्छ परिपक्व शुक्राणु Spermatogonia Spermatid 14 + 35 पुच्छ परिपक्व शुक्राणु स्टेम सेल Spermatocyte 28 + 3 पुच्छ परिपक्व शुक्राणु Spermatocyte Spermatocyte Spermatid परिपक्व शुक्राणु नलिकाओं स्टेम सेल स्टेम सेल स्टेम सेल Spermatogonia सपाermatogonia Spermatogonia Spermatocyte Spermatocyte Spermatid Spermatid 28 + 49 पुच्छ परिपक्व शुक्राणु स्टेम सेल स्टेम सेल नलिकाओं स्टेम सेल Spermatogonia Spermatocyte Spermatid स्टेम सेल स्टेम सेल विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा ट्रांसजेनिक कृंतक उत्परिवर्तन परख द्वारा लक्षित कर रहे हैं कि तालिका 1 प्रकार की कोशिकाओं और शुक्राणुजनन के चरणों. खुराक समूह पशु # उत्परिवर्ती pfu कुल pfu म्यूचुअल फंड (X10 -5) औसत म्यूचुअल फंड (x 10 -5) मोड़ो परिवर्तन पी मूल्य नियंत्रण 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 – 2 4 137835 2.9 3 11 385672 2.9 4 2 431396 0.5 5 6 152413 3.9 25 मिलीग्राम / किग्रा 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0.0002 7 14 150094 9.3 8 4 154401 2.6 9 9 154401 5.8 10 12 196978 6.1 50 मिलीग्राम / किग्रा 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0.0001 12 11 135847 8.1 13 25 193499 12.9 14 12 133859 </ TD> 9.0 15 14 252807 5.5 100 मिलीग्राम / किग्रा 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0.0001 17 28 234584 11.9 18 10 145289 6.9 19 35 292236 12.0 20 22 190848 11.5 तालिका 2 ट्रांसजेनिक पुरुष मीटर की पुच्छ शुक्राणु में lacZ उत्परिवर्ती आवृत्तिवे spermatogonial स्टेम कोशिकाओं (= 1 दिन प्रशासन समय, नमूने समय = 70 दिन) थे जब बर्फ ENU को तीव्रता से अवगत कराया. Pfu पट्टिका गठन इकाई, म्यूचुअल फंड = उत्परिवर्ती आवृत्ति =. चित्रा 1 λgt10 फेज के निर्माण का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. चित्रा 2 ट्रांसजेनिक कृंतक रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख की एक रूपरेखा. चित्रा 3 माउस में शुक्राणुजनन और प्रकार की कोशिकाओं और फंस का एक योजनाबद्ध आरेखविभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा ट्रांसजेनिक कृंतक उत्परिवर्तन परख द्वारा लक्षित कर रहे हैं कि तों नोट:.. स्नातक सफेद सलाखों बीजदार नलिकाओं से तैयार सेल निलंबन में मौजूद प्रकार की कोशिकाओं (यानी spermatids> spermatocytes> spermatogonia> स्टेम सेल) के सापेक्ष अनुपात का प्रतिनिधित्व करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. माउस पुच्छ अधिवृषण के 4 संग्रह चित्रा. ए)) अंडकोश. बी की ओर पेट में एक चीरा धीरे वृषण और अधिवृषण बाहर आकर्षित करने के लिए वसा पैड खींच) अधिवृषणी वसा पैड. सी पहचानें. डी) का पता लगाएँ और पुच्छ अधिवृषण आबकारी. <p claरखने together.within पृष्ठ = "हमेशा">: के लिए एस एस = "jove_content" बीजदार नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं के निलंबन की 5 तैयारी चित्रा. एक) एक चीरा के लिए एक 5-10 डिग्री कोण पर बीजदार नलिकाओं कैप्सूल. सी) एक ऊतक रोलर धीरे नलिकाओं पर पारित किया है से बाहर निचोड़ा हैं बीजदार tubules. बी) उजागर वृषण की उपकला कैप्सूल में किया जाता है . डी के भीतर निहित रोगाणु कोशिकाओं) रोगाणु सेल निलंबन आगे की प्रक्रिया के लिए एकत्र किया जाता है जारी. MutaMouse शुक्राणु में lacZ उत्परिवर्ती आवृत्ति की चित्रा 6 ग्राफिकल प्रतिनिधित्व (एन = 5) ENU के लिए स्टेम कोशिकाओं के रूप में तीव्रता से अवगत कराया. प्रत्येकत्रिकोण एक पशु के शेयरों में प्रतिनिधित्व करता है. * पी <0.05 पॉसों प्रतिगमन द्वारा निर्धारित रूप में. सजीले टुकड़े के साथ ट्रांसजेनिक कृंतक उत्परिवर्तन परख से 7 चित्रा प्रतिनिधि अगर प्लेट ई के एक लॉन पर गठित कोलाई मेजबान बैक्टीरिया. क) "उत्परिवर्ती" प्लेटें कभी कभी कुछ प्लेटों पर शून्य सजीले. ख) "अनुमापांक" प्लेटों सजीले टुकड़े के सैकड़ों हो सकता होगा जो विशेष रूप से नियंत्रण खुराक समूहों में तीर के साथ चिह्नित बहुत कुछ सजीले टुकड़े (),, होगा.

Discussion

पारंपरिक तरीकों की तुलना में, TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख विवो रोगाणु सेल उत्परिवर्तन में प्रेरित बढ़ाता का एक तेज, और अधिक किफायती, और अधिक संवेदनशील साधन प्रदान करता है. वंश, पशुओं की संख्या के लिए विरोध के रूप में, शुक्राणु में सीधे transgene म्यूचुअल फंड का आकलन करके, समय और किसी एक यौगिक के germline mutagenicity का आकलन करने के लिए आवश्यक संसाधन काफी कम है. संवेदनशीलता के मामले में, हम खुराक समूह में केवल 5 पशुओं का उपयोग कर 25 मिलीग्राम / किग्रा ENU के संपर्क में निम्नलिखित spermatogonia स्टेम सेल म्यूचुअल फंड में एक महत्वपूर्ण 2.6 गुना वृद्धि का पता लगाने में सक्षम थे. इसके विपरीत, विशिष्ट ठिकाना परख का उपयोग कर इस एक ही खुराक में म्यूचुअल फंड में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन> उजागर समूह में 3,000 चूहों और> 5,00,000 नियंत्रण चूहों ²⁸ का पता लगाने में असमर्थ था.

दोनों यंत्रवत और विनियामक जांच के लिए इसकी उपयुक्तता के अलावा, इस विधि दैहिक और रोगाणु लाइन mutati के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान करता हैदरों पर. हाल ही में सबूत दैहिक उत्परिवर्तन के लिए आवश्यकता से कुछ एजेंटों के लिए रोगाणु सेल उत्परिवर्तन कम एकाग्रता में प्रेरित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एन hydroxymethylacrylamide के लिए लंबे समय तक निवेश, खाद्य कैसरजन acrylamide ¹² की एक metabolite, लाल रक्त कोशिकाओं में micronucleus आवृत्ति, दैहिक सेल सितोगेनिक क नुकसान ¹³ की एक पारंपरिक उपाय को प्रभावित किए बिना चूहों में प्रमुख घातक रोगाणु सेल उत्परिवर्तन की आवृत्ति बढ़ जाती है. साथ ही, रक्त micronucleus आवृत्ति ¹⁴ में वृद्धि नहीं करते कि खुराक में शुक्राणु में मिलकर दोहराएँ डीएनए loci में दोनों मुख्यधारा और sidestream तंबाकू के धुएं कारणों बुलंद उत्परिवर्तन आवृत्तियों के लिए चूहों का जोखिम. इन निष्कर्षों दैहिक genotoxicity परीक्षण हमेशा germline की रक्षात्मक है कि इस धारणा को चुनौती, और रोगाणु सेल उत्परिवर्तन आवृत्ति यों के लिए एक अधिक कुशल और लागत प्रभावी साधन के लिए मांग को सुदृढ़. हालांकि, तरजीही रोगाणु सेल उत्परिवर्तजन के लिए सबूत अभी भी कमजोर हैकाफी हद तक वजह से दैहिक और रोगाणु सेल के ऊतकों में उत्परिवर्तन दरों की तुलना के लिए उपलब्ध डेटा की कमी की. TGR उत्परिवर्तन परख समानांतर परीक्षण और उसी transgene का उपयोग कर कई ऊतकों में प्रेरित उत्परिवर्तन दरों की तुलना की अनुमति देता है. इस प्रकार, तुलनात्मक उत्परिवर्तन तरजीही रोगाणु सेल प्रभाव की संभावना आसपास के डेटा अंतराल को भरने में मदद मिलेगी TGR परख का उपयोग परीक्षण.

नियामक के परीक्षण के लिए दैहिक और रोगाणु सेल उत्परिवर्तन के एक साथ आकलन भी आवश्यक जानवरों की संख्या कम दक्षता में सुधार होगा. दैहिक उत्परिवर्तन के लिए ओईसीडी दिशानिर्देश एक तीन दिन नमूने समय (+3 28) के बाद 28 दिन प्रशासन समय, की सिफारिश की. यह शुक्राणुजनन की spermatocyte और spermatid चरणों (चित्रा 3) के दौरान ज्यादातर उजागर कोशिकाओं को लक्षित करता है के बाद से पुच्छ शुक्राणु का विश्लेषण, इस समय बिंदु पर गरीब संवेदनशीलता प्रदान कर सकता है. इन चरणों में कोशिकाओं के डीएनए synthesize और उत्तरोत्तर डीएनए की मरम्मत ⁶ के लिए अपनी क्षमता खो नहीं है ^</ Sup>. इसके अलावा, इस समय बिंदु पर नमूना पुच्छ शुक्राणु spermatogonia और स्टेम कोशिकाओं में होने वाली म्यूटेशन का पता लगाने में विफल हो जाएगा. इस प्रकार, 28 + 3 डिजाइन में एकीकरण के लिए, ओईसीडी दिशानिर्देश बीजदार नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करने की सिफारिश की. इस मिश्रित आबादी डीएनए संश्लेषण और स्टेम सेल सहित मरम्मत प्रवीण प्रकार की कोशिकाओं से व्युत्पन्न सेल शामिल हैं, और spermatogenic चरणों का बहुमत भर में सामने आ रहे हैं. हालांकि, इन कोशिकाओं के मिश्रित प्रकृति के कारण, बीजदार tubules सेल विश्लेषण चरण में विशेष जानकारी प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, गैर लक्ष्य कोशिकाओं की उपस्थिति में मनाया शेयरों में प्रभावित कर सकते हैं कि चिंता का विषय है (उदाहरण के कारण डीएनए की मरम्मत की कमी जर्म कोशिकाओं से एक उत्परिवर्तित रोगाणु सेल संकेत के उत्परिवर्तित दैहिक कोशिकाओं के संक्रमण, या कमजोर पड़ने के लिए झूठी सकारात्मक रोगाणु सेल उत्परिवर्तजन कॉल) . वर्तमान में समाप्त करने के लिए पर्याप्त डाटा नहीं है कि क्या 28 + 3 प्रस्ताव एक ही संवेदनशीलता और विशिष्टता एक पर बीजदार नलिकाओं कोशिकाओं से परिणामबाद में समय बिंदुओं पर है पुच्छ शुक्राणु. हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में इस बात का पता करने के लिए विभिन्न नमूने समय के बाद एकत्र बीजदार नलिकाओं कोशिकाओं और पुच्छ शुक्राणु में प्रेरित किया गया म्यूचुअल फंड की तुलना है. हम ओईसीडी दिशानिर्देश ऐसे भी रोगाणु सेल विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है कि जिगर के रूप में धीरे धीरे विभाजित ऊतकों के लिए 28 दिनों का एक वैकल्पिक नमूने समय से पता चलता है कि ध्यान दें. फिर भी, उपलब्ध आंकड़ों अभी भी अपर्याप्त है और हम दैहिक कोशिकाओं और विनियामक परीक्षण के लिए TGR उत्परिवर्तन परख का उपयोग जर्म कोशिकाओं का एक साथ विश्लेषण के लिए एक एकल प्रायोगिक डिजाइन की सिफारिश करने में असमर्थ हैं.

ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस परख की एक विशेषता mutational घटनाओं में एक गैर murine transgene पर मूल्यांकन कर रहे हैं. हालांकि, transgene अंतर्जात जीन ²⁰ के लिए एक समान फैशन में पर्यावरण उत्परिवर्तजन का जवाब सुझाव है कि पर्याप्त सबूत नहीं है. इसके अलावा, क्योंकि स्वतंत्र mutational घटनाओं की सटीक मूल करने के लिए मुश्किल हो जाता हैहल, परिणाम आम तौर पर (एक उत्परिवर्तन आवृत्ति के विपरीत) एक उत्परिवर्ती आवृत्ति के रूप में सूचित कर रहे हैं. परिणाम डीएनए अनुक्रमण द्वारा (transgene म्यूटेंट का मनाया आवृत्ति में योगदान कर सकते हैं कि एक एकल उत्परिवर्तित सेल यानी. विभाजन और गुणा) क्लोनल विस्तार के लिए सही कर रहे हैं अगर वास्तविक उत्परिवर्तन आवृत्ति हल किया जा सकता है. इस समय और विश्लेषण की लागत को काफी कहते हैं, हालांकि उत्परिवर्ती transgenes की अनुक्रमण, lacZ म्यूटेशन की विशेषताएँ, और क्लोनल विस्तार घटनाओं से प्राप्त किया जा सकता है कि म्यूटेंट की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. छोटा (294 3021 बी.पी. lacZ बनाम बीपी, चित्रा 1) और ²⁹ दृश्य के लिए आसान है जो λ सीआईआई जीन, का एक संस्करण: lacZ जीन के अलावा, theλgt10 ट्रांसजेनिक वेक्टर एक विकल्प के तापमान पर निर्भर उत्परिवर्तन-रिपोर्टर जीन बंदरगाहों. अनुक्रमण भी mutatio में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, प्रेरित उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण परमिटसवाल में परिसर के अंतिम तंत्र. क्लोनल विस्तार का एक चरम उदाहरण एक "खजाना" उत्परिवर्तन की घटना है (यानी., Transgene एक नाटकीय रूप से ऊंचा म्यूचुअल फंड के लिए योगदान है कि एक अंग के विकास का एक बहुत ही प्रारंभिक चरण में म्यूटेशन, कभी कभी सैकड़ों पृष्ठभूमि से अधिक समय के हजारों करने के लिए). एक "खजाना" उत्परिवर्तन के साथ जानवरों या ऊतकों विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए.

हम वर्णन किया है कि परख ऐसी ⁽²⁰ में समीक्षा) समान उत्परिवर्तन संवाददाता वैक्टर बंदरगाह जो सभी के BigBlue माउस और चूहे, और lacZ प्लाज्मिड माउस के रूप में अन्य TGR मॉडल के लिए मोटे तौर पर लागू है. इसी तरह के तरीकों को रोजगार उस तारीख को आयोजित रोगाणु सेल के अध्ययन के विशाल बहुमत ऐसे ENU और ⁽³⁰ में समीक्षा) विकिरण के रूप में लगभग विशेष रूप से पर अच्छी तरह से विशेषता उत्परिवर्तजन ध्यान केंद्रित किया है. यह TGR परख के लिए ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश की हाल ही में रिलीज के साथ, इस परख हो जाएगा कि उम्मीद हैरासायनिक स्क्रीनिंग और नियामक मूल्यांकन के लिए तेजी से लोकप्रिय. एक विनियामक परीक्षण बैटरी में TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख का निगमन रोगाणु कोशिकाओं ¹¹ में उत्परिवर्तन प्रेरण के कुशल मूल्यांकन की अनुमति से मौजूदा खाई को भरने जाएगा. इसके अलावा, इस परख समान आनुवंशिक समापन पर पर्यावरण एजेंटों द्वारा म्यूटेशन की प्रेरण के लिए दैहिक कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं के रिश्तेदार संवेदनशीलता की तुलना के लिए एक उपयुक्त साधन उपलब्ध कराने, वास्तव में किसी भी ऊतक में म्यूचुअल फंड को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
MutaMouse	Covance	–
E.coli (lacZ–/galE–)	Covance	–	See reference 25 in manuscript
Chloroform	Caledon	3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS)	Gibco	14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8	Sigma-Aldrich	03690 FLUKA
Isoamyl alcohol	Caledon	2/10/7900
Lennon LB broth base	Invitrogen	12780-029
Stainless steel mesh filter	Sigma-Aldrich	S3770
Transpack packaging extract	Agilent Technologies	200220
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)	Commercial Alcohols	–
Ampicilin	Gibco	11593-027	prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin	Gibco	11815-024	prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol	Invitrogen	15509-097	Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal)	Sigma-Aldrich	P6501	dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K	Invitrogen	25530-031	prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc)	Fisher Scientific	BP333-500	prepare 3M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L4390	prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4			24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
20% maltose solution			20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months
Bottom agar			Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X  8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates
LB Broth			5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC)			150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0
SM Buffer			5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer			10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8
Top agar, mutant plates			Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM
Top agar, titre plates			Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L