Fremgangsmåde til at opnå primær ovariecancer celler fra Solid Prøver
Summary
Denne undersøgelse beskriver en detaljeret metode til isolering og karakterisering af primære kræft i æggestokkene celler fra faste kliniske prøver. Ovariecancer kliniske prøver er udsat for enzymatisk fordøjelse at opnå levedygtig, fibroblast-fri epitelial kræft i æggestokkene (EOC) celler yderst velegnet til downstream-anvendelser.
Abstract
Pålidelige værktøjer til at undersøge ovariecancer initiering og progression er et presserende behov. Mens brugen af ovariecancer cellelinier stadig et værdifuldt redskab til at forstå ovariecancer, deres anvendelse har mange begrænsninger. Disse omfatter den manglende heterogenitet og overfloden af genetiske ændringer er forbundet med udvidet in vitro passage. Her beskriver vi en metode, der giver mulighed for en hurtig etablering af primære kræft i æggestokkene celler danne faste kliniske prøver indsamlet på tidspunktet for operationen. Metoden består i at underkaste kliniske prøver til enzymatisk nedbrydning i 30 minutter. Det isolerede cellesuspension lov til at vokse og kan anvendes til efterfølgende anvendelse, herunder medicin screening. Fordelen ved primær ovariecancer cellelinjer end etablerede æggestokkene kræft cellelinjer er, at de er repræsentative for de oprindelige specifikke kliniske prøver de stammer fra, og kan afledes fra forskellige steder, om primary eller metastatisk ovariecancer.
Introduction
På trods af sin relativt lave incidens, kræft i æggestokkene er den mest dødelige af de gynækologiske sygdomme og den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinder 1,2. Dette er primært på grund af manglen på pålidelige værktøjer og modeller, der trofast rekapitulere initiering og progression af sygdommen 3.. De fleste af vores viden i dag om kræft i æggestokkene har været muligt ved hjælp af udødeliggjort æggestokkene overflade epithelceller (tabere), kræft i æggestokkene cellelinjer og primære kræft i æggestokkene celler udvundet fra ascitesvæske 4-7. Desværre, deres anvendelse har flere begrænsninger, herunder en række af genetiske og fænotypiske ændringer i forbindelse med immortalization proces eller in vitro-passager og heterogenitet i befolkningen som følge af væske forberedelse ascitiske.
Derfor primær ovariecancer celler fra identificerbare og specifikke faste eksemplarer af kræft i æggestokkene repræsenterer en unique værktøj til at studere ovariecancer progression.
De største vanskeligheder i forbindelse med opnåelse af disse maligne celler skyldes en overvækst af stromaceller eller fibroblaster sammen med tab af levedygtighed og for tidlig mangel på proliferativ kapacitet i kulturen i disse EOC celler. I øjeblikket findes flere metoder til at skabe encellede suspensioner fra solide tumorer, ved hjælp af mekaniske midler eller enzymatisk dissociation dog visse teknikker giver en større mængde af det foretrukne resultat 8. Her viser vi, at enzymatisk nedbrydning med dispase II resultater i en effektiv inddrivelse af levedygtige, fibroblast-fri EOC celler. De således opnåede EOC kulturer er meget modtagelige for genetisk manipulation, og er også anvendelige i lægemiddel-screening tests indikerer, at disse EOC kulturer er velegnet til mange efterfølgende anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
En bedre forståelse af kræft i æggestokkene ætiologi og udvikling er afgørende for at forbedre resultatet af kvinder ramt af denne ødelæggende sygdom. I denne sammenhæng etableret brugen af og "kommercielt tilgængelige" kræft i æggestokkene cellelinie har uden tvivl været uhyre nyttigt. , Vi i dag kender dog, at kræft cellelinjer er ikke repræsentative for den menneskelige tumor de stammede fra i mange aspekter, herunder den manglende heterogenitet 9,10.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke personalet i anlægget af University of Minnesota udtagning af væv for at få hjælp med patient vævsprøver kollektion. Dette arbejde blev støttet af Department of Defense æggestokkene Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, som Randy Shaver Cancer Research og EU-fond til MB, som Minnesota Kræft i æggestokkene Alliance til MB og ved gynækologisk onkologi afdelings fond til MB. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| REAGENTS: | |||
| 1X PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile (Thermoscientific) | Thermoscientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x penicillin-streptomycin, liquid (Invitrogen) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile (Roche) | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml conical capped tubes, sterile (BD Falcon) | BD, Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical capped tubes, sterile (BD Falcon) | BD, Falcon | 352027 | |
| 10 ml serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile (BD Falcon) | BD Falcon | 352350 | |
| 5-cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10-cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. h. i. h. Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
