विखंडन टुकड़े का पता लगाने के साथ वर्तमान माप के संयोजन से उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के proteolytic सक्रियण के प्रदर्शन
Summary
Heterologously Xenopus में व्यक्त उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के proteolytic सक्रियण oocytes कोशिका की सतह पर आयन चैनल दरार उत्पादों की उपस्थिति की जांच के लिए एक biotinylation दृष्टिकोण के साथ वर्तमान माप के संयोजन के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता laevis. कार्यात्मक महत्वपूर्ण दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग करके पहचाना जा सकता है.
Abstract
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Introduction
Proteases जटिल विनियामक संकेत दे रास्ते में शामिल अत्यधिक परिष्कृत प्रोटीज Cascades करने, पाचन के संदर्भ में, प्रोटीन की प्रसिद्ध proteolytic गिरावट से लेकर विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल कर रहे हैं कि एंजाइमों हैं. Proteases उनके उत्प्रेरक सक्रिय साइट के अनुसार सात समूहों में वर्गीकृत कर रहे हैं: एस्पार्टेट, asparagine, सिस्टीन, glutamic एसिड, metallo, सेरीन, और threonine proteases. विभिन्न proteases हमेशा एक प्रोटीन की प्राथमिक संरचना से भविष्यवाणी करने के लिए आसान नहीं हैं जो अलग दरार साइटों को लक्षित. मेरोप्स डेटाबेस ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) proteases और उनके तरजीही दरार साइटों की एक विस्तृत श्रृंखला के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है. कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग कर पहचाना जा सकता है.
यह अच्छी तरह से ENaC के proteolytic प्रसंस्करण वीं की सक्रियता का एक महत्वपूर्ण तंत्र है कि स्थापित हैविशेष आयन चैनल 1,2 है. दिलचस्प है, संबंधित एसिड संवेदन आयन चैनल 1 ए (ASIC1a) के समारोह में भी proteases 3-5 से संशोधित किया जा सकता है कि सबूत है. वर्तमान में यह प्रोटियोलिटिक चैनल दरार अन्य आयन चैनल या ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को विनियमित करने में एक प्रासंगिक शारीरिक भूमिका निभाता है एक खुला प्रश्न बना हुआ है. हालांकि, यह अच्छी तरह से proteolytic दरार जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स, प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर्स (PARs) के एक समूह को सक्रिय करता है कि स्थापित है 6. कई सेरीन proteases (जैसे चैनल को सक्रिय proteases (CAP1 -3), काइमोट्रिप्सिन, trypsin, furin, plasmin, न्युट्रोफिल इलास्टेज, और kallikrein) proteolytically ENaC 2 को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है. सेरीन proteases के अलावा, proteases के अन्य समूहों प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण में शामिल हो सकता है. दरअसल, हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि metalloproteinase meprin-β 7 और सिस्टीन प्रोटीज cathepsin-S 8 भी कर सकते हैं ACTIVAते ENaC. हालांकि, ENaC सक्रियण के लिए (patho-) physiologically प्रासंगिक proteases निर्धारित किया जा रह है और ऊतकों को ऊतक से अलग हो सकता.
Proteases preferentially अमीनो एसिड अनुक्रम में विशेष स्थलों पर फोड़ना जाना जाता है. उदाहरण के लिए, सेरीन प्रोटीज काइमोट्रिप्सिन खुशबूदार एमिनो एसिड फेनिलएलनिन और tyrosine अवशेषों के बाद cleaving एक विशिष्ट दरार पैटर्न से पता चलता है. बुनियादी अवशेषों लाइसिन या arginine के बाद इसके विपरीत, सेरीन प्रोटीज trypsin preferentially cleaves. साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा उत्पन्न उत्परिवर्ती मानव γENaC निर्माणों का प्रयोग, heterologously oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली में व्यक्त ENaC में कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों 8-13 पहचाना जा सकता है.
पृथक oocytes में तीन ENaC सब यूनिटों (αβγ) के लिए क्रेना इंजेक्शन लगाने के द्वारा, ENaC कार्यात्मक इन कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है और प्लाज्मा झिल्ली में मौजूद चैनलों की गतिविधि से मापा जा सकता हैदो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक का उपयोग कर. मूत्रवर्धक amiloride, एक विशिष्ट ENaC अवरोध करनेवाला, amiloride संवेदनशील ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल वर्तमान घटक (ΔI एमी) का उपयोग करके unspecific रिसाव धाराओं से या अन्य आयन चैनल द्वारा आयोजित धाराओं से अलग किया जा सकता है. इस प्रकार, ΔI एमी मूल्यों समग्र ENaC गतिविधि प्रतिबिंबित और amiloride के अभाव में दर्ज की इसी पूरे सेल धाराओं से amiloride की उपस्थिति में मापा पूरे सेल धाराओं घटाकर द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. एक प्रोटीज ENaC पर एक उत्तेजक प्रभाव है कि क्या परीक्षण करने के लिए, ΔI एमी यानी पहले और एक प्रोटीज युक्त समाधान में oocyte के ऊष्मायन के बाद, एक ही oocyte में दो बार मापा जाता है. दूसरा माप के लिए पहले से ΔI एमी की वृद्धि हुई है प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण इंगित करता है. काइमोट्रिप्सिन या trypsin ज़्यादा से ज़्यादा oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली 2,14 में ENaC को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता है और आत्मविश्वास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआरएम कि प्रोटियोलिटिक ENaC सक्रियण oocytes की एक दिया बैच में detectable है.
पूरे सेल वर्तमान मापन के लिए समानांतर में, एक biotinylation दृष्टिकोण 9 ENaC की उपस्थिति के साथ संबद्ध कोशिका की सतह पर टुकड़े दरार ΔI एमी में वृद्धि proteases को oocytes के जोखिम पर पता चला है कि क्या जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिका की सतह पर प्रोटीन बायोटिन साथ लेबल रहे हैं और Neutravidin लेबल agarose मोती को biotinylated प्रोटीन बंधन से intracellular प्रोटीन से अलग किया जा सकता है. biotinylated प्रोटीन वेस्टर्न ब्लॉट से विश्लेषण किया जा सकता है. कोशिका की सतह पर γENaC दरार टुकड़े γENaC की सी टर्मिनस में एक मिलान के खिलाफ निर्देशित एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइट (ओं) की पहचान करने के लिए, दरार साइटों साइट निर्देशित mutagenesis का उपयोग उत्परिवर्तित हो सकता है की भविष्यवाणी की. Wildtype और उत्परिवर्ती चैनल एस से oocytes का उपयोग समानांतर प्रयोगों में तुलना कर रहे हैंएएमई बैच.
इस पद्धति दृष्टिकोण के साथ यह ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल धाराओं के proteolytic सक्रियण कोशिका की सतह पर टुकड़े दरार ENaC के समय पर निर्भर उपस्थिति के साथ संबद्ध है कि पहली बार के लिए प्रदर्शन किया गया. इन परिणामों चैनल दरार और चैनल सक्रियण के बीच एक कारण लिंक का सुझाव. इसके अलावा, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक, plasmin के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक दरार साइटों, 13 काइमोट्रिप्सिन और cathepsin-S 8 के साथ संयोजन में ख्यात दरार साइटों की साइट निर्देशित mutagenesis के उपयोग पहचान की गई.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में सफलतापूर्वक proteases से ENaC की सक्रियता अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था, जो एक methodological दृष्टिकोण 8,13 वर्णित है. अच्छी तरह से स्थापित Xenopus laevis oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली कार्यात्मक एक्सप्रेस ENaC के लिए इस्तेमाल किया गया था. ENaC समारोह परंपरागत दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना तकनीक के साथ मूल्यांकन किया गया था. साइट निर्देशित mutagenesis के कार्यात्मक प्रासंगिक प्रोटीज दरार साइटों की पहचान करने के लिए नियुक्त किया गया था. Electrophysiological माप के साथ समानांतर में प्रदर्शन Biotinylation प्रयोगों यह संभव ENaC की उपस्थिति प्रोटियोलिटिक वर्तमान सक्रियण के साथ कोशिका की सतह पर उत्पादों दरार सहसंबंधी कर दिया. वर्तमान सक्रियण के समय के पाठ्यक्रम और कोशिका की सतह पर proteolytic दरार टुकड़े की उपस्थिति के बीच एक संबंध प्रोटियोलिटिक चैनल सक्रियण की अवधारणा का समर्थन करता है.
दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग एक हे की कोंचना आवश्यकतादो microelectrodes साथ ocyte. यह प्रक्रिया आम तौर पर एक व्यक्ति oocyte में केवल एक बार किया जाता है. हालांकि, यह oocyte को स्पष्ट क्षति के बिना एक प्रारंभिक पूरे सेल वर्तमान रिकॉर्डिंग के बाद microelectrodes दूर करने के लिए संभव था. दरअसल, impalements की साइटों पर प्लाज्मा झिल्ली कुछ ही मिनटों के भीतर reseal करने के लिए प्रकट होता है. इस प्रकार, एक पहले दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप पूरा करने के बाद, यह एक microfuge ट्यूब या से भरा एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना सेटअप की प्रयोगात्मक प्रवाह चैम्बर से oocyte स्थानांतरित करना संभव है परीक्षण या नियंत्रण समाधान की एक छोटी मात्रा. बाद में, एक ही oocyte प्रवाह चैम्बर वापस स्थानांतरित किया जा सकता है और एक दूसरे से दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप प्रदर्शन करने के लिए फिर से impaled जा सकता है. उल्लेखनीय है, ENaC की मध्यस्थता धाराओं oocyte नियंत्रण समाधान में बनाए रखा गया था जब पहले और दूसरे माप के बीच बहुत भिन्न नहीं था. एक प्रोटीज युक्त प में oocyte के विपरीत, ऊष्मायन मेंपहली माप के बाद ution दूसरा माप में वृद्धि ENaC की मध्यस्थता वर्तमान चित्रा (2) में हुई. यह निष्कर्ष प्रोटियोलिटिक चैनल सक्रियण इंगित करता है.
एक एकल oocyte में दो अलग वर्तमान माप प्रदर्शन oocyte परीक्षण समाधान की एक छोटी मात्रा में समय की एक चर लंबाई के लिए दो माप के बीच proteases या अन्य औषधीय एजेंटों के संपर्क में किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता है. बड़ी मात्रा में महंगी और / या उपलब्ध नहीं हैं जो एजेंटों, जैसे शुद्ध प्रोटीज तैयारियों का उपयोग करते समय यह महत्वपूर्ण है. एजेंटों की सीमित उपलब्धता की वजह से लगातार प्रति मिनट कई मिलीलीटर के प्रवाह की दर के साथ oocytes superfusing के लिए आवश्यक परीक्षण समाधान की बड़ी मात्रा के लिए यह असंभव है (या unaffordable) निरंतर दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग में उन्हें इस्तेमाल करने के लिए कर सकते हैं. इसके अलावा, लगातार दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना माप प्रसिद्ध Phenom द्वारा सीमित हैंसहज चैनल ठहरनेवाला के Enon भी ENaC 15 के लिए वर्णित है. इसके विपरीत, एक घंटे या उससे अधिक के लिए के लिए दो अलग माप के बीच समाधान का परीक्षण करने के oocytes उजागर नहीं आम तौर पर (चित्रा -4 ए देखें) एक समस्या खड़ी करता है. अंत में, एक ही oocyte में प्रदर्शन दो अनुक्रमिक माप दवा प्रभाव की बनती टिप्पणियों अनुमति देते हैं. यह आमतौर पर आयन चैनल अभिव्यक्ति में मनाया oocytes के बीच उच्च परिवर्तनशीलता की समस्या को कम करता है, क्योंकि यह oocytes (प्रोटीज का इलाज और वाहन का इलाज) के दो अलग अलग समूहों से unpaired माप पर एक फायदा है. बनती टिप्पणियों और पहली माप के लिए डेटा मानक के अनुसार करने की संभावना के साथ, कम oocytes एक औषधीय एजेंट के एक महत्वपूर्ण प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगात्मक समूह प्रति की जरूरत है. डेटा को सामान्य बनाने के लिए भी यह आसान विभिन्न आयन चैनल अभिव्यक्ति के स्तर और इसलिए विभिन्न आधारभूत धाराओं (चित्रा 2 डी के साथ oocytes के विभिन्न बैचों से डेटा का सारांश करने के लिए बनाता है). इस दृष्टिकोण के हित के आयन चैनल गतिविधि (देखें चित्र 2) दूसरा माप के लिए पहले से वाहन का इलाज नियंत्रण oocytes में स्थिर बनी हुई है कि प्रदर्शित करने के लिए जाहिर है, नियंत्रण प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.
Proteolytic वर्तमान सक्रियण कोशिका की सतह पर उत्पादों दरार ENaC की उपस्थिति के साथ संबद्ध दिखाना है कि, एक biotinylation दृष्टिकोण मूल रूप से हैरिस एट अल द्वारा वर्णित. 9 इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रक्रिया (प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत और 4 चित्र में दिखाया गया है) proteases और ENaC की मध्यस्थता धाराओं के बाद सक्रियण दरार टुकड़े के समय पर निर्भर उपस्थिति द्वारा paralleled है करने के लिए चैनलों की है कि जोखिम को प्रदर्शित करने के लिए अनुकूलित किया गया था. biotinylation विधि भी कोशिका की सतह पर एक समग्र वृद्धि या झिल्ली प्रोटीन की कमी के विश्लेषण की अनुमति देता है. इस प्रकार, इस विधि proteases और अन्य Phar के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयुक्त हैप्लाज्मा झिल्ली में या चैनल पुनर्प्राप्ति पर चैनल प्रविष्टि पर macological एजेंटों. इसके अलावा, biotinylated प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की अनुमति देता प्रोटीन टुकड़े (जैसे प्रोटियोलिटिक ENaC टुकड़े) या कार्यात्मक प्रासंगिक हो सकता है जो ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न में परिवर्तन का पता लगाने.
अंत में, विधियों के संयोजन ENaC की मध्यस्थता पूरे सेल धाराओं पर proteases की stimulatory प्रभाव की जांच के लिए और आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है ENaC की घटना के साथ एक संबंध कोशिका की सतह पर उत्पादों की दरार का प्रदर्शन किया. विशेष रूप से, इन तरीकों अन्य आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों या transmembrane रिसेप्टर्स (जैसे प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर्स PARs) के नियमन के बारे में इसी तरह के सवालों का पता करने के लिए उपयुक्त हो सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Materials
| Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
| Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
| E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
| left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
| LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
| magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
| OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
| P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
| right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
| Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
| STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
| vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
| Material | |||
| INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
| Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
| standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
| Reagent | |||
| complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
| Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
| NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
| NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
| Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
| SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | |
References
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