EPRは、補因子の酸化還元滴定を監視対象<em>サッカロマイセス·セレビシエ</em> Nar1
Summary
The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.
Abstract
電子常磁性共鳴（EPR）は、酸化還元滴定は、強力な方法は、タンパク質中の補因子の中点電位を決定し、それらの検出可能なレドックス状態に補因子を同定および定量するために監視されている。
それは電子伝達率に関する情報を提供していませんが、検討中のタンパク質に補因子のアイデンティティと酸化還元状態を確立しないような技術は、直接電気化学（ボルタンメトリー）のアプローチ、と相補的である。技術は、電子常磁性共鳴（EPR）検出可能な補因子を含有する任意のタンパク質に広く適用可能である。
典型的な滴定は1〜100μMの範囲の補因子の濃度が2ミリリットルのタンパク質が必要です。タンパク質は、特定の電位における試料ポイズのために、化学的還元剤（亜ジチオン酸ナトリウム）または酸化剤（フェリシアン化カリウム）で滴定する。白金線及びAg / AgCl参照電極をボルトに接続されている。タンパク質溶液の電位を測定するための計器。 13の異なるレドックスメディエーターのセットは、タンパク質の酸化還元補因子と電極との間に平衡化するために使用される。試料タンパク質の異なる酸化還元補因子に特徴的な、異なる電位および電子常磁性共鳴スペクトルで描かれているが、測定される。試料電位に対する信号強度のプロットは、補因子の中点電位を決定するために、ネルンストの式を使用して分析される。
Introduction
それはこの惑星、光合成、窒素固定と呼吸に生命を維持する最も基本的な化学プロセスは、有機および無機の酸化還元補因子の広い範囲を含む大きなタンパク質複合体によって触媒されることに顕著である。これは、全てのタンパク質の約30％が1つまたは複数の金属補因子を含んでいると推定されている。1,2は 、酸化還元補因子を直接電気化学（ 例えば 、タンパク質フィルムボルタンメトリー）または酸化還元滴定を使用して確立することができる識別し特徴付ける。 2の技術は、その性質や適用性で相補的である。ボルタンメトリーは電極表面と反応することができるの中点電位および補因子の電子移動速度の速い決定を提供しています。3,4は通常、このようなシトクロムcまたはフェレドキシンなどの電子伝達タンパク質、に適しています。そして、それは時々、電極表面に固定化されたより複雑なタンパク質のために働く。の詳細な知識タンパク質における補因子の性質は、ボルタングラムは、補因子のアイデンティティ上の任意の直接的な情報を与えることはありませんように、利用可能でなければならない。レドックス滴定は、タンパク質のmgの量を実行し、必要とする方が面倒である。しかしながら、それらは中間電位と補因子のアイデンティティに関する情報を提供する。 図5は、さらに、単一の滴定にタンパク質内の複数の補因子を監視することができる。
酸化還元滴定の原理は、レドックス活性タンパク質または酵素は、化学的に還元または酸化されることである。補因子は、還元剤または酸化剤の酸化還元メディエーターが使用されていると反応していることを確認するために。溶液の電位を測定することができるように、これらの酸化還元メディエーターは、電極と反応する。メディエーターは、酸化還元緩衝剤として作用し、蛋白質と電極における補因子との間で平衡化する。 AW化学的に所望の値に電位をpoisingした後、サンプルが引き出されるとすぐに液体窒素中で凍結させ分光技術とのさらなる分析をAIT。 EPR分光法は、それを定量的に常磁性金属中心または有機基を測定するために使用することができるように、この点で特に有用である。
酸化還元滴定は、二方向に実行することができます：ローからハイに、またはハイからロー中間電位に。選択は、研究対象の補因子の安定性に依存している。多くの場合、低電位で開始し、可能性を高める段階的に酸化剤を追加することが賢明です。これは、酸化滴定と呼ばれ、ここで説明されている。ここでは、 出芽酵母由来のタンパク質Nar1を含む鉄-硫黄クラスターの酸化還元滴定を示した。このタンパク質は、細胞質の鉄硫黄クラスター生合成機構（CIA経路）において、足場タンパク質として、可能性が関与している。6,7
Protocol
Representative Results
Discussion
13レドックスメディエーターのシリーズは-0.45からSHEに対して0.3 V（ 表1および図3）の範囲内の溶液中での酸化還元平衡を可能にする。さて上およびこれらの電位以下のすべてのメディエーターは、どちらか完全に還元または完全に酸化、したがって、タンパク質の酸化還元活性中心との更なる平衡化が発生しないことができている。時々還元滴定は、狭い範囲11?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、財政的に化学設計（NRSC-触媒反応）によって制御オランダの国立研究学校コンビネーション、触媒反応から研究助成金によってサポートされていました。ライデン大学から博士HY Steensma博士とGPHバンフースデンは、Sの組換え発現との支援のために認められている出芽酵母 Nar1。
Materials
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) ·(HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
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