Denne artikkelen gir en protokoll for utvinning av gift fra edderkopper som bruker elektrisk stimulering for å 1) gjennomføre proteomikk karakterisering, 2) stimulere gift kjertel genuttrykk, og 3) utføre funksjonelle studier av gift. Dette etterfølges av en beskrivelse av gift kjertel microdissections for genuttrykk studier.
Gifter er kjemisk komplekse sekreter vanligvis omfatter flere proteiner og peptider med varierte fysiologiske aktiviteter. Funksjonell karakterisering av gift proteiner har viktige biomedisinske applikasjoner, inkludert identifisering av narkotika ledninger eller sonder for cellulære reseptorer. Edderkopper er den mest artsrike clade av giftige organismer, men gift på bare noen få arter er godt forstått, delvis på grunn av vanskelighetene forbundet med å samle inn ørsmå mengder av giften fra små dyr. Dette notatet presenterer en protokoll for innsamling av gift fra edderkopper ved hjelp av elektrisk stimulering, demonstrere prosedyren på den vestlige sorte enke (Latrodectus Hesperus). De innsamlede gift er nyttig for varierte nedstrøms analyser inkludert direkte protein identifisering via massespektrometri, funksjonelle analyser, og stimulering av gift genuttrykk for transcriptomic studier. Denne teknikken har den fordelen over protokoller som isosent gift fra hele kjertel homogenates, som ikke skiller ekte gift komponenter fra cellulære proteiner som ikke er utskilt som en del av giften. Representative resultater demonstrerer deteksjon av kjente gift peptider fra den oppsamlede prøven ved hjelp av massespektrometri. Giften samling prosedyre følges av en protokoll for å dissekere edderkoppgift kjertler, med resultatene som viser at dette fører til karakterisering av gift-uttrykte proteiner og peptider ved sekvensnivå.
Gifter er dyr sekreter hovedsakelig injisert inn i et annet dyr med henblikk på predasjon eller forsvar, og har også viktige biologiske applikasjoner med biomedisinsk relevans 1-3. Bare visse dyr syntetisere gift, men produksjonen er taksonomisk utbredt over virvelløse dyr (f.eks, nesledyrene, kjegle snegler, skorpioner og edderkopper) og virveldyr (f.eks, slanger, noen fisk og pattedyr), fordi den har uavhengig utviklet seg flere ganger 1,4 . Biokjemisk karakterisering av gifter viser vanligvis de er sammensatt av et bredt utvalg av proteiner og peptider, noe som i stor grad virke på sirkulasjons- og nervesystemene hos injiserte dyr å raskt levere en konstituerende toksiner. En liten brøkdel av giftige dyr kan utgjøre en trussel for mennesker, spesielt arter med synanthropic distribusjoner 5. Studiet av gift sammensetning og funksjonelle aktiviteter har spilt en viktig rolle ifunksjonell karakterisering av virveldyr cellulære komponenter (spesielt nevronale ionekanaler) 6 og i å belyse grunnleggende cellulære prosesser (f.eks neurosekresjon) 7. Videre velger gift peptider har nyttige egenskaper i biomedisinske sammenhenger, inkludert deres anvendelser som behandlinger for kreft og smerter 8,9, og er minelagt for kandidat narkotika fører og antivenom utvikling. Gifter også spille fremtredende roller i økologisk og evolusjonær forskning 1,4,10,11, og dermed innsamling av disse farlige sekreter har mange verktøy.
Det er> 40 000 beskrevne arter av edderkopp (Order Araneae), og alle unntatt én av de mer enn 100 edderkoppfamilier besitter paret gift kjertler som avsluttes i fangs 12. Den høye artsmangfoldet av edderkopper tyder på at de representerer den største clade av giftige organismer. Imidlertid har biokjemisk karakterisering av edderkoppgift largely konsentrert på et lite antall arter oftest forbundet med menneskelig envenomation. Nyere proteomikk og transcriptomic studier av edderkopp venoms indikerer de vanligvis inneholder mange unike proteiner og peptider 2,13,14. Fremskritt i høy gjennomstrømming cDNA sekvensering og massespektrometri peptid fingerprinting har i stor grad oppdagelsen av disse gift proteiner 15. Likevel begynner slikt arbeid med innsamling av tilstrekkelig gift og / eller gift kjertler fra edderkopper, og detaljert dokumentasjon for slike teknikker er få 16.
Dette notatet presenterer en protokoll for innsamling av gift og gift kjertler fra black widow edderkopper, som kan brukes på samme størrelse edderkopper. Samlingen av venom separat fra kjertlene muliggjør identifisering av proteiner som skilles ut i giften i motsetning til andre cellulære proteiner som utfører funksjoner. Svarte enker og andre Latrodectus arter er anerkjent for å være blant de farligste edderkoppene på grunn av deres svært nevrotoksisk gift, som forårsaker store smerter hos mennesker, som er noen ganger ledsaget av rikelig svette, muskelsammentrekninger, høyt blodtrykk, pustevansker og usammenhengende lammelser 5. Giften samling protokoll som presenteres her bruker elektrostimulering for å levere elektrisk strøm til bedøvede edderkopper å lokke fram muskelsammentrekninger og frigjøring av giften. Venom dråper blir raskt innhentet med mikrokapillærer og utlevert til rør for fryselager. Fordi protokollen innebærer farlige prosedyrer, bør det bare utføres av godt utdannede personer og forsiktighet oppfordret på viktige skritt. Det oppsamlede venom har en rekke anvendelser, som for eksempel karakterisering og isolering av bestanddelsmolekyler 2, for fysiologiske eksperimenter eller funksjonelle analyser 18, og for å stimulere venom genekspresjon 11. Protokollen avsluttes med en description av venom kjertel disseksjon og bevaring nyttig for kloning av gift-spesifikke gener, hvis ekspresjon er vist å forekomme 2-3 dager etter venom uttømming i forskjellige edderkopper 10,11.
Gifter representerer en viktig kilde til fysiologisk reaktive proteiner, peptider og andre molekyler med søknader om medisiner, samt for grunnleggende aspekter av mobilnettet og økologisk forskning 1-3. Men innsamling av giften, særlig fra farlige eller små dyr, er en utfordrende oppgave. Denne protokollen viser hvordan gift og gift kjertler kan hentes fra black widow edderkopper, og bekrefter suksess for denne tilnærmingen via en kombinasjon av mudpit analyse av gift og en protein database avledet fra cDNAs klonet fra gift kjertler 21. Mens denne protokollen fungerer godt for svarte enker og mellomstore edderkopper, andre gift samling teknikker har vært ansatt i større mygalomorph (tarantella-aktig) edderkopper, for eksempel direkte aspirasjon av giften fra hoggtenner i glass pipetter for eksempel 24. Denne sistnevnte tilnærming, men , ikke vil fungere godt for mindre store edderkopper som ikke aggressive.
Et spesielt viktig aspekt av gift samling protokollen beskrevet her er de innledende faser av fremstillingen og optimalisering av innsamlingsprosessen, slik at det blir mer rutine, konsekvent og raskere. Protokollen er i utgangspunktet utfordrende å mestre, men med gjentatte forsøk, blir det lettere og raskere. Forsiktighet er også oppfordret til alle kritiske faser som involverer håndtering av farlige edderkopper, bruk av elektrisk strøm, fin-point glassmikrokapillærer, og sprøytespisser. Det er viktig å bruke egnet personlig verneutstyr som nitrilhansker, en labfrakk, lange bukser og lukkede sko, samt briller når du forme mikrokapillærer.
Et annet utfordrende aspekt til gift samlingen er den lille mengden av gift produsert av noen edderkopp, spesielt Latrodectus arter, der beløpene samlet kan være liMited til 1-2 mikroliter per individ i beste fall. Innhente tilstrekkelig gift for nedstrøms applikasjoner, for eksempel protein gels eller funksjonelle analyser kan kreve en kombinasjon av gift fra flere individer i en tube. I slike tilfeller bør gift kun kombineres fra individer av samme kjønn, ontogenetisk stadium, og befolkningen gitt anerkjennelse av intersex, utviklingsmessige og geografiske variasjoner i enkelte venoms 25, 26. Edderkopper kan også utvise stor variasjon i hvor mye gift som produseres blant enkeltpersoner, der mindre mengder kan gjenspeile den siste uttømming av kjertelen. Dermed kan det være lurt å samle gift flere dager etter deres siste fôring. Hvis lite gift slippes, bør mye strøm ikke brukes til edderkoppen, som kan føre til at skjellaget til å sprekke, noe som fører til forurensning av gift med hemolymph eller død.
Forurensning av gift prøver med edderkopp silk eller menneskelige kilder bør også unngås gjennom bruk av sterilt eller rent utstyr. Til tross for disse utfordringene, samling av ren gift, slik at edderkoppen i live, er å foretrekke å skaffe fremgangsmåter som gift fra homogenater kjertel (som ikke skiller gift komponenter fra andre cellulære proteiner) og drepe edderkoppen. Det er også kritisk for å sikre at prøver blir hurtig frosset for å hindre at proteinnedbrytingen.
Utvinning av giften fremmer senere gift produksjon, og dermed stimulere gift genuttrykk i giften kjertelen. Således, fordi denne protokollen tillater edderkopper å overleve venom uttømming, deres kjertler kan bli dissekert flere dager senere (drepe edderkoppen) på et punkt hvor venom genekspresjon er forventet å være tilstrekkelig for genetiske studier, for eksempel transkripsjon kloning 10,11. Flere viktige forholdsregler må også tas i gift kjertel disseksjoner. Bør det legges vekt på å bruke lab utstyr;ent og reagenser som er fri for RNases som bryter ned RNA. Dermed anbefales det å tørke tang og andre ikke-engangsutstyr og overflater med løsninger som eliminerer RNase og DNA-kontaminering. Disseksjonene bør utføres så raskt som mulig, og direkte frosset for ytterligere å sikre integriteten av RNA vevet. Til slutt, disseksjoner bør bare utføres på bedøvede edderkopper, etter deres cephalothorax og abdomen er raskt separert.
I konklusjonen, gir denne artikkelen en verifisert protokollen for å få edderkopp gift og gift kjertler. Venom og gift kjertler tillate for isolering og karakterisering av sine proteiner og peptider komponenter ved hjelp av proteomikk og transcriptomic tilnærminger. I tillegg kan gift prøvene representerer startpunktet for funksjonelle analyser, som bestemmer den biomedisinske og farmakologiske potensialet i sine bestanddelsmolekyler. Nesten alle edderkopper produserer gift, og den brede dykkertetet i gift komponenter syntetisert av enkeltarter antyder et stort mangfold av gift molekyler er ennå ikke oppdaget 13. Følgelig gir denne protokollen verktøy for å undersøke rik kilde av biologisk aktive molekyler tilstede i edderkoppgift.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker følgende personer for deres hjelp i utviklingen av denne protokollen: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, og Mays Imad. Massespektrometri og proteomikk data ble kjøpt av Arizona Proteomikk Consortium støttes av NIEHS stipend ES06694 til SWEHSC, NIH / NCI stipend CA023074 til AZCC og ved BIO5 Institute ved University of Arizona. Midler til dette arbeidet ble gitt fra National Institutes of Health (National Institute of General Medicine) fra tilskudd 1F32GM83661-01 og 1R15GM097714-01 til Jessica E. Garb.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |