Den här artikeln innehåller ett protokoll för utvinning av giftet från spindlar som använder elektrisk stimulering för att 1) genomföra proteomic karakterisering, 2) stimulera gift körtel genuttryck, och 3) utföra funktionella studier av gifter. Detta följs av en beskrivning av giftkörtel microdissections för gen-expressionsstudier.
Gifter är kemiskt komplexa sekret vanligtvis innefattar många proteiner och peptider med olika fysiologiska aktiviteter. Funktionell karakterisering av giftproteiner har viktiga biomedicinska tillämpningar, inbegripet identifieringen av läkemedels leads eller sonder för cellulära receptorer. Spindlar är de mest artrika klad av giftiga organismer, men de gifter om bara några få arter är väl förstådd, delvis på grund av svårigheten i samband med att samla in små mängder av giftet från små djur. Denna uppsats presenterar ett protokoll för insamling av giftet från spindlar som använder elektrisk stimulering, vilket visar proceduren på västra svarta änkan (Latrodectus hesperus). Den insamlade gift är användbar för olika nedströms analyser inklusive direkt proteinidentifiering via masspektrometri, funktionella analyser och stimulering av gift genuttryck för transcriptomic studier. Denna teknik har fördelen över protokoll som isosen giftet från hela körtelhomogenat, som inte separerar äkta giftkomponenter från cellulära proteiner som inte utsöndras som en del av giftet. Representativa resultat visar detektion av kända gift peptider från det insamlade provet med hjälp av masspektrometri. Förfarandet gift kollektionen följs av ett protokoll för dissekera spider giftkörtlar, med resultat som visar att detta leder till att en grundvattengiftuttryckt proteiner och peptider på sekvensnivå.
Gifter är djursekret övervägande injiceras i ett annat djur i syfte att predation eller försvar, och har även viktiga biologiska tillämpningar med biomedicinsk relevans 1-3. Endast vissa djur syntetisera gift, men produktionen är taxonomiskt utbredd över ryggradslösa djur (t.ex., nässeldjur, kon sniglar, skorpioner och spindlar) och ryggradsdjur (t.ex. ormar, vissa fiskar och däggdjur), eftersom det har självständigt utvecklats flera gånger 1,4 . Biokemisk karakterisering av gifter visar vanligtvis de består av en mängd olika proteiner och peptider, som i stor utsträckning verkar på cirkulations och nervsystemet hos injicerade djur att snabbt leverera ingående gifter 1. En liten del av giftiga djur kan utgöra ett hot mot människor, särskilt arter med synanthropic fördel 5. Studiet av giftet sammansättning och funktionella aktiviteter har spelat en viktig roll iden funktionella karakteriseringen av ryggradsdjur cellulära komponenter (särskilt neuronala jonkanaler) 6 och belysa grundläggande cellulära processer (t.ex. neurosekre) 7. Dessutom väljer gift peptider har användbara egenskaper i biomedicinska sammanhang, inklusive deras användning som behandlingar för cancer och smärta 8,9, och bryts för läkemedelskandidat leder och motgift utveckling. Gifter också spela framträdande roller i ekologisk och evolutionär forskning 1,4,10,11, alltså insamling av dessa farliga sekret har många verktyg.
Det finns> 40.000 beskrivna arter av spindel (Order Araneae), och alla utom en av de mer än 100 spider familjer besitter parade giftkörtlar som avslutas i huggtänder 12. Den höga artrikedom av spindlar tyder på att de representerar den största kladen av giftiga organismer. Men biokemisk karakterisering av spindelgifter har largely koncentrerad till ett litet antal arter som oftast förknippas med mänsklig envenomation. Senaste proteomik och transcriptomic studier av spindel gift anger de innehåller oftast många unika proteiner och peptider 2,13,14. Framsteg inom high-throughput cDNA sekvensering och masspektrometri peptid fingeravtryck har i hög grad underlättat upptäckten av dessa giftproteiner 15. Ändå börjar detta arbete med insamling av tillräcklig gift och / eller giftkörtlar från spindlar, och detaljerad dokumentation för sådana tekniker är få 16.
Denna uppsats presenterar ett protokoll för insamling av gift och giftkörtlar från svarta änkan, som kan tillämpas på liknande storlek spindlar. Insamlingen av giftet separat från körtlar möjliggör identifiering av proteiner som utsöndras i giftet i motsats till proteiner som utför andra cellulära funktioner. Svarta änkor och andra Latrodectus arter är allmänt erkända som bland de farligaste spindlar på grund av deras mycket neurotoxiska gift, som orsakar svår smärta hos människor, som ibland åtföljs av kraftig svettning, muskelsammandragningar, högt blodtryck, andningssvårigheter och ojämn förlamning 5. Giftet samling protokoll som presenteras här använder elektrostimulering för att leverera elektrisk ström till sövda spindlar att framkalla muskelsammandragningar och frisättning av gift. Venom droppar snabbt samlas med mikro kapillärer och fördelas i rör för frysförvaring. Eftersom protokollet omfattar farliga förfarandena bör det endast utföras av välutbildade individer och försiktighet uppmanas vid viktiga steg. Den insamlade giftet har många användningsområden, såsom karakterisering och isolering av ingående molekyler 2, för fysiologiska experiment eller funktionella analyser 18, och stimulera gift genuttryck 11. Protokollet avslutas med en description gift körtel dissektion och bevarande användbar för kloning av giftspecifika gener vars uttryck har visats förekomma 2-3 dagar efter gift utarmning i olika spindlar 10,11.
Gifter utgör en viktig källa till fysiologiskt reaktiva proteiner, peptider och andra molekyler med tillämpningar för läkemedelsutveckling, samt för grundläggande aspekter av cellulär och ekologisk forskning 1-3. Men insamlingen av giftet, särskilt från farliga eller små djur, är en utmanande uppgift. Detta protokoll visar hur gift och giftkörtlar kan samlas in från svarta änkan, och bekräftar framgången för denna strategi genom en kombination av MuDPIT analys av giftet och en proteindatabas härlett från cDNA klonad från giftkörtlar 21. Även om detta protokoll fungerar bra för svarta änkor och medelstora spindlar, andra tekniker gift insamling har använts för större mygalomorph (tarantel-liknande) spindlar, till exempel direkt aspiration av giftet från huggtänder i glas pipetter t.ex. 24. Detta senare synsätt, men , inte kommer att fungera bra för mindre stora spindlar som inte är aggressive.
En särskilt viktig aspekt av giftet uppsamlings protokoll som beskrivs här är de inledande faserna av utarbetande och optimering av insamlingen så att det blir mer rutin, konsekvent och snabbare. Protokollet är inledningsvis utmanande att bemästra, men med upprepade försök, blir det lättare och snabbare. Försiktighet uppmanas också vid alla kritiska moment som innefattar hantering av farliga spindlar, användning av elektrisk ström, fin-punkt glasmikro kapillärer och kanyler. Det är viktigt att bära lämplig personlig skyddsutrustning som nitrilhandskar, en labbrock, långa byxor och stängda skor, liksom glasögon vid utformningen mikro kapillärer.
En annan utmanande aspekt gift samling är den lilla mängden gift som produceras av någon spindel, särskilt Latrodectus arter, från vilken de belopp som samlas in kan vara limited till 1-2 mikroliter per individ i bästa fall. Att få tillräckligt med gift för tillämpningar efter, till exempel protein geler eller funktionella analyser kan kräva en kombination av giftet från flera personer i ett rör. I sådana fall bör gift endast kombineras från individer av samma kön, ontogenetiska skede, och befolkningen med tanke på erkännandet av intersexuell, utvecklande och geografisk variation i vissa gifter 25, 26. Spindlar kan också uppvisa stor variation i mängden gift som produceras mellan individer, där mindre mängder kan återspegla den senaste tidens utarmning av körteln. Således kan det vara lämpligt att samla gift flera dagar efter sin sista utfodring. Om lite gift släpps, bör överström inte tillämpas på spindeln, som kan orsaka nagelbanden att brista, vilket leder till förorening av giftet med hemolymfa eller död.
Förorening av giftprover med spindel silk eller mänskliga källor bör också undvikas genom användning av sterila eller ren utrustning. Trots dessa utmaningar, insamling av ren gift, lämnar spindel vid liv, är att föredra framför metoder som erhåller giftet från körtelhomogenat (som inte separerar giftkomponenter från andra cellulära proteiner) och dödar spindeln. Det är också viktigt att se till att prover snabbt fryses för att förhindra proteinnedbrytning.
Utvinningen av giftet främjar senare gift produktion, vilket stimulerar gift genuttryck i giftet körteln. Således, eftersom detta protokoll möjliggör spindlar att överleva gift utarmning, deras körtlar kan dissekerade flera dagar senare (döda spindeln) vid en punkt där gift genuttryck förväntas vara tillräcklig för genetiska studier, som avskrift kloning 10,11. Flera viktiga försiktighetsåtgärder måste också tas i giftkörteln dissektioner. Tyngdpunkten bör läggas på att använda lab equipment och reagens som är fria från RNaser som bryter ned RNA. Det rekommenderas därför att torka pincett och annan återanvändbar utrustning och ytor med lösningar som eliminerar RNas och DNA kontaminering. De dissektioner bör utföras så snabbt som möjligt och direkt fryst för att ytterligare säkerställa RNA integritet vävnaden. Slutligen bör dissektioner endast utföras på sövda spindlar, efter deras Kroppen och buken snabbt separeras.
Sammanfattningsvis här artikeln ger en verifierad protokoll för att få spindel gift och giftkörtlar. Venom och giftkörtlar möjliggöra isolering och karaktärisering av deras protein- och peptidkomponenter som använder proteomik och transcriptomic tillvägagångssätt. Dessutom kan giftprover representerar startpunkten för funktionella analyser, som bestämmer det biomedicinska och farmakologiska möjligheterna för deras ingående molekyler. Nästan alla spindlar producerar gift, och det breda dykarefald av giftkomponenter syntetiserade av enskilda arter antyder en stor mångfald av giftmolekylerna ännu inte upptäckt 13. Följaktligen tillhandahåller detta protokoll verktyg för att undersöka rik källa av biologiskt aktiva molekyler som är närvarande i spindelgifter.
The authors have nothing to disclose.
Jag tackar följande personer för deras hjälp i utvecklingen av detta protokoll: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier och Mays Imad. Masspektrometri och proteomikdata förvärvades av Arizona Proteomics konsortiet stöds av NIEHS bidrag ES06694 till SWEHSC, NIH / NCI bidrag CA023074 till AZCC och av BIO5 Institute vid University of Arizona. Finansieringen av detta arbete lämnades från National Institutes of Health (National Institute of General Medicine) från bidrag 1F32GM83661-01 och 1R15GM097714-01 till Jessica E. Garb.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |