नवजात extrahepatic Cholangiocytes का अलगाव
Summary
नवजात चूहों के extrahepatic पित्त नलिकाओं से cholangiocytes अलग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया है. नलिकाओं सावधानी से विच्छेदित कर रहे हैं, और फिर कोशिकाओं मोटी कोलेजन जैल में परिणाम के द्वारा अलग कर रहे हैं. इस विधि में extrahepatic पित्त नली विकास और विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
Abstract
जिगर के अंतर और extrahepatic पित्त नलिकाओं developmentally अलग कर रहे हैं, और विभिन्न प्रकार से कुछ बीमारियों से प्रभावित हो सकता है. हालांकि, अंतर और extrahepatic cholangiocytes, और नवजात और वयस्क कोशिकाओं के बीच के बीच मतभेद है, अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं.
Intrahepatic पित्त नलिकाओं से cholangiocytes के अलगाव के लिए तरीकों अच्छी तरह से 1-4 स्थापित कर रहे हैं. इस विशिष्ट cholangiocyte आबादी के बीच अंतर को समझने में और extrahepatic नलिकाओं को लक्षित करने के लिए दिखाई देते हैं कि इस तरह के पित्त अविवरता जैसे रोगों का अध्ययन करने में काफी लाभ होगा, हालांकि विशेष रूप से नवजात शिशु से extrahepatic वाहिनीपरक कोशिकाओं के अलगाव, अभी तक, वर्णित नहीं किया गया है. नवजात और वयस्क माउस दोनों extrahepatic पित्त नली कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित तकनीक यहाँ है वर्णित है. इस तकनीक fibroblasts तरह mesenchymal कोशिकाओं से कम से कम प्रदूषण के साथ एक शुद्ध सेल आबादी पैदावार.
इस methoडी सूक्ष्म विच्छेदन और वसा और fibroblast परतों को हटाने के लिए scraping द्वारा पीछा extrahepatic नलिकाएं और पित्ताशय की थैली, को हटाने पर आधारित है. संरचनाएं प्रायोगिक इस्तेमाल के लिए तो trypsinized किया जा सकता है और चढ़ाया रहे हैं जो monolayers में cholangiocytes, के परिणाम अनुमति देने के लिए लगभग 3 सप्ताह के लिए कोलेजन और सुसंस्कृत की मोटी परतों में एम्बेडेड रहे हैं.
Introduction
अंतर और extrahepatic cholangiocytes की उत्पत्ति और विकास स्पष्ट रूप से अलग हैं. जिगर उदर अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर 5 के एक diverticulum से विकसित करता है. कपाल क्षेत्र intrahepatic पित्त पेड़ 5 उत्पन्न जबकि diverticulum की दुम क्षेत्र, extrahepatic पित्त पेड़ रूपों. Intrahepatic वाहिनी cholangiocytes पेरी पोर्टल क्षेत्रों 6 में ductal थाली के चारों ओर पूर्वज कोशिकाओं से निकाली गई है. इन कोशिकाओं को hepatocytes या cholangiocytes 6 या तो में अंतर करने की क्षमता है. इस cholangiopathies विशेष रूप से cholangiocytes के एक वर्ग को लक्षित कर सकते हैं कि दिए गए महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ हैं. Alagille सिंड्रोम intrahepatic नलिकाओं को प्रभावित करता है, जबकि उदाहरण के लिए, पित्त अविवरता शुरू में, नवजात शिशु की extrahepatic नलिकाओं को प्रभावित करता है.
चूहों और चूहों से intrahepatic cholangiocytes और पित्त नली इकाइयों के अलगाव के कई वर्णन कर रहे हैं. मेंvestigators वाहिनी अलगाव और बाद के परिणाम के द्वारा एकल कक्षों पृथक, या जिगर पाचन और एंटीबॉडी द्वारा विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों 1-4 व्यक्त cholangiocytes के नीचे खींच लिया है. कार्यात्मक और ध्रुवीकृत पित्त नली इकाइयों जिगर पाचन और आकार निस्पंदन 7 से पृथक किया गया है. पित्त नली इकाइयों पृथक cholangiocytes विट्रो 1,2 में ductular संरचनाओं को विकसित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि उत्तेजनाओं स्रावी और तरल पदार्थ का स्राव 7 प्रदर्शित करने के लिए जवाब देने में सक्षम हैं. इन तरीकों की सीमाओं पाचन एंजाइमों के साथ जिगर छिड़काव के लिए विशेष तकनीकी विशेषज्ञता और विशेष उपकरणों की आवश्यकता शामिल हैं. इसके अलावा, mesenchymal कोशिकाओं 3 के साथ प्रदूषण का खतरा है.
विशेष रूप से नवजात extrahepatic पित्त नलिकाओं से, extrahepatic पित्त नली cholangiocytes अलग करने के लिए एक विधि है, पहले से वर्णित नहीं किया गया है. इस पत्र में नवजात एक अलग करने के लिए एक सरल तकनीक की रूपरेखाअच्छी तरह से शुद्धता के उच्च स्तर पर वयस्क extrahepatic पित्त नली कोशिकाओं के रूप में एस. इस तकनीक अंतर और extrahepatic cholangiocytes और extrahepatic नलिकाओं को नुकसान पित्त अविवरता जैसी बीमारियों के तंत्र में अनुसंधान के बीच मतभेद का अध्ययन की सुविधा होगी.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित नवजात शिशुओं सहित सभी उम्र के चूहों के चूहों के extrahepatic पित्त नलिकाओं से शुद्ध cholangiocytes अलग करने के लिए एक तकनीक है. तकनीक extrahepatic cholangiocytes intrahepatic cholangiocytes से अलग से अध्ययन किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पाचन में आण्विक अध्ययन के लिए UPenn NIDDK केंद्र के आण्विक रोग विज्ञान और इमेजिंग कोर और इमेजिंग के साथ सहायता के लिए लीवर रोग (P30 DK50306) के लिए आभारी हैं. यह काम (RGW के लिए), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 डी.के. 092,111) से और फ्रेड और सुजान Biesecker बाल यकृत केन्द्र से अनुदान द्वारा और (एस के लिए) बचपन लिवर रोग अनुसंधान और शिक्षा नेटवर्क से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
References
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